本文選題：結(jié)核分枝桿菌　切入點：pcD85B　出處：《重慶醫(yī)科大學》2005年碩士論文

【摘要】：目的: 本研究擬構(gòu)建編碼結(jié)核分枝桿菌 H37Rv Ag85B DNA 疫苗,一方面將該疫苗經(jīng)小鼠鼻粘膜免疫,探討其在小鼠體內(nèi)誘導的免疫應答及機制;另一方面研究在 BCG初免后,將該疫苗滴鼻免疫進行增強免疫所誘導的免疫應答及機理。以上設計試圖為結(jié)核病疫苗尋找最佳免疫途徑和方案,為結(jié)核病的粘膜免疫防治提供理論和實驗依據(jù)。 方法: 1、用 PCR 和基因克隆技術(shù)構(gòu)建真核表達質(zhì)粒 pcD85B,Ag85B 編碼基因亞克隆 入原核表達質(zhì)粒 pET32a 中, 純化重組的 Ag85B 蛋白,制備 Ag85B 抗血清; pcD3.1(+)、pcD85B、轉(zhuǎn)染 COS-7 細胞,用 RT-PCR、ELISA 和斑點印跡的方 法鑒定目的基因的表達;pcD3.1(+)、pcD85B 免疫 C57BL/6 小鼠,ELISA 法 測量免疫后相應的 PPD 特異性抗體和脾淋巴細胞 IL-4 以及 IFN-γ分泌水 平,MTT 法檢測 PPD 特異性脾淋巴細胞增殖能力,評價 DNA 疫苗的免疫原性。 2、將 PBS、pcD3.1、pcD85B(滴鼻時溶于 PBS 或者以脂質(zhì)體包裹)分別以肌 注和滴鼻免疫 C57BL/6 小鼠,采用 ELISA 法測量免疫后相應的 PPD 特異性 抗體和脾淋巴細胞 IL-4 以及 IFN-γ分泌水平; CTL 試驗評估小鼠 CD8+T 細胞的殺傷活性。 3、C57BL/6 小鼠分三組,一組皮下接種 BCG,另外兩組在 BCG 接種 14 周后, 分別以脂質(zhì)體包裹的 pcD3.1、pcD85B 滴鼻進行增強免疫;采用 ELISA 法測 量免疫后相應的 PPD 特異性抗體和脾淋巴細胞 IL-4 以及 IFN-γ分泌水平; CTL 試驗評估小鼠 CD8+T 細胞的殺傷活性。 結(jié)果: 1、 經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切及DNA雙向測序證實pcD85B真核表達質(zhì)粒構(gòu)建成 功;用重組的 Ag85B 蛋白制備的鼠抗 Ag85B 血清效價為 1:64;重組質(zhì)粒 4 轉(zhuǎn)染 COS-7 細胞后, Ag85B 多克隆抗體通過 ELISA 法檢測到細胞培養(yǎng)上 清液 Ag85B 的表達,對照組為為陰性反應;pcD85B 免疫 C57BL/6 小鼠, 末 次免疫后 4 周各組 PPD 特異性抗體水平均有不同程度增高,脾淋巴細胞 PPD 特異性 IFN-γ分泌水平以及脾淋巴細胞增殖能力均增高。 2、 脂質(zhì)體包裹的 pcD85B 滴鼻途徑①可誘導局部粘膜免疫 BALF 中的 sIgA 抗 體滴度最高(P0.05),但血清中 IgA 的抗體滴度不高;②可誘導產(chǎn)生 Th1 型細胞免疫。該組 IFN-γ水平較高,與同樣用脂質(zhì)體包裹的載體對照比, 有顯著差異(P0.05),與肌注組無顯著差異(P0.05),低于 BCG 組 (P0.05)。溶于 PBS 的 DNA 疫苗組 IFN-γ水平非常低,低于載體對照組、 肌注組和 BCG 組(P0.05)。該組 IL-4 水平很低,與肌注組、陽性對照 BCG 組、以及生理鹽水 DNA 滴鼻組相比,都有顯著差異(P0.05)。該試 驗組 IgG2a 抗體滴度較高,和肌注組、陽性對照 BCG 組相比無顯著差異 (P0.05);與生理鹽水 DNA 滴鼻組有顯著差異(P0.05)。③體液免疫較 弱 血清 IgG 抗體水平低于肌注組和 BCG 組。④CTL 試驗 通過不同組別顆 粒酯酶分泌百分率(%)來反映細胞毒性 T 細胞的功能。該指標在不同免 疫途徑區(qū)別不大,除與 PBS 對照有區(qū)別外,與載體對照差別甚微。 3、 BCG 皮下初免,pcD85B 滴鼻增強的方案強于單純 BCG 皮下免疫對照組,表 現(xiàn)在①粘膜免疫 它的 BALF 中的 sIgA 抗體滴度高于 BCG 組(P0.05)。② 體液免疫 該組的特異性 IgG 抗體滴度略低于 BCG 組 ③Th1 型細胞免疫 檢測 PPD 刺激的脾淋巴細胞培養(yǎng)上清,其 IFN-γ 水平稍低于 BCG 組,但明 顯高于 pcD85B 肌注組;IL-4 水平明顯低于 BCG 組和肌注組,特異性 IgG2a 的抗體滴度高于 BCG 組(P0.05)。④細胞殺傷活性 通過不同組別顆粒酯 酶分泌百分率(%)來反映細胞毒性 T 細胞的功能。該組顆粒酯酶分泌百 分率 86.3946%,低于 BCG 組的 93.3333%。 結(jié)論: 1、 pcD85B 疫苗構(gòu)建成功, 能在 COS-7 細胞中分泌表達,可誘導小鼠產(chǎn)生特異 性體液免疫和細胞免疫。 2、 脂質(zhì)體包裹的 DNA 疫苗組與同等劑量的肌注組產(chǎn)生的系統(tǒng)免疫差別不大, 弱于 BCG 組;溶于 PBS 的 DNA 疫苗組弱于同等劑量的脂質(zhì)體組和肌注組, 也弱于 BCG 組;DNA 疫苗可以進行滴鼻嘗試。
[Abstract]:Purpose :








This study intends to construct a DNA vaccine coding for Mycobacterium tuberculosis H37Rv Ag85B . On the one hand , the immune response and mechanism induced by the vaccine in mice were discussed . On the other hand , the immune response and mechanism induced by the immunization of the vaccine were enhanced after BCG vaccination . The above design tried to find the best immune route and protocol for tuberculosis vaccine and provide theoretical and experimental basis for the prevention and treatment of tuberculosis .








Method :








1 . The eukaryotic expression plasmid pcD85B was constructed by PCR and gene cloning . Ag85B encoding gene was subcloned into prokaryotic expression plasmid pET32a . The recombinant Ag85B antiserum was purified . The recombinant Ag85B antiserum was prepared . pcD3.1 ( + ) and pcD85B were transfected into COS - 7 cells .








2 . PBS , pcD3.1 , pcD85B ( in PBS or liposome - coated ) were injected into the C57BL / 6 mice respectively by intramuscular injection and intranasal immunization respectively . The corresponding PPD - specific antibodies and IL - 4 and IFN - 緯 secretion levels were measured by ELISA . The cytotoxic activity of CD8 + T cells in mice was assessed by CTL assay .








3 銆，

本文編號：1730249