本文選題：抗病毒蛋白　切入點(diǎn)：原核表達(dá)　出處：《吉林大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 以已有的大腸桿菌及酵母生物特性和分子背景為依據(jù),在不改變開放閱讀框架(ORF)的情況下,對所獲得的CVN序列列進(jìn)行密碼子優(yōu)化和定點(diǎn)突變,采用全基因合成的方法,人工合成CVN的全序列。為了增強(qiáng)對病毒的中和活性,本實(shí)驗(yàn)借助InsightⅡ生物信息學(xué)分析軟件,在對CVN空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源模建的基礎(chǔ)上,用一個(gè)含有15個(gè)氨基酸的linker將兩個(gè)CVN基因進(jìn)行串聯(lián)構(gòu)建成2CVN。分別克隆入原核表達(dá)載體pET-28a(+)中,獲得pET-CVN和pET-2CVN原核表達(dá)質(zhì)粒。 利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),對CVN和2CVN基因進(jìn)行了表達(dá)。表達(dá)的目的蛋白主要以包涵體形式存在。通過NI2+親和層析的方法對包涵體成功地進(jìn)行了復(fù)性和純化。 為進(jìn)一步檢測重組蛋白的生物活性,將HIV外膜糖蛋白基因gp160和gp120連入真核表達(dá)載體pDisplay中,轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,人工制備HIV靶細(xì)胞模型。G418篩選,SDS-PAGE,Western blot與IFA分析表明成功獲得穩(wěn)定表達(dá)HIV-gp160和HIV-gp120的靶細(xì)胞模型。通過ELISA和IFA技術(shù)對CVN和2CVN的結(jié)合活性進(jìn)行檢測,結(jié)果表明二者均可與外膜糖蛋白結(jié)合,并且初步判定2CVN蛋白的結(jié)合活性高于CVN蛋白。該結(jié)果為進(jìn)一步研究抗HIV制劑奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
[Abstract]:Based on the biological characteristics and molecular background of Escherichia coli and yeast, and without changing the open reading frame (ORF), the CVN sequence was optimized for codon optimization and site-directed mutation, and the whole gene synthesis method was used.The entire sequence of synthetic CVN.In order to enhance the neutralization activity of CVN, two CVN genes were constructed by using a 15-amino acid linker on the basis of homologous modeling of CVN spatial structure with the help of Insight 鈪，

本文編號：1730588