本文選題：低氧誘導(dǎo)因子α　切入點(diǎn)：重組腺病毒　出處：《中國(guó)生物工程雜志》2014年03期

【摘要】：目的:采用AdEasy重組腺病毒系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒Ad-HIF1α并進(jìn)行鑒定。方法:使用高保真PCR從EST克隆中擴(kuò)增HIF1α基因編碼區(qū),并用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Xba I對(duì)PCR片段限制性酶切,用T4 DNA連接酶將其連接至同樣經(jīng)BamH I和Xba I限制性酶切的穿梭載體pAdtrace-TO4,構(gòu)建穿梭載體pAdtrace-HIF1α;將pAdtrace-HIF1α與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在細(xì)菌BJ5183中同源重組,得到重組腺病毒質(zhì)粒pAd-HIF1α;pAd-HIF1α經(jīng)Pac I酶切后轉(zhuǎn)染至E1表達(dá)包裝細(xì)胞系HEK293中進(jìn)行HIF1α基因表達(dá)腺病毒包裝,重復(fù)擴(kuò)增,氯化銫密度梯度離心法純化,獲得高滴度Ad-HIF1α;感染干細(xì)胞株C3H10T1/2,通過(guò)熒光蛋白的表達(dá)了解其感染效率,并應(yīng)用PCR及Western blot驗(yàn)證目的基因的表達(dá),并通過(guò)檢測(cè)下游靶基因VEGF的表達(dá),了解該載體表達(dá)的目的蛋白的生物活性。結(jié)果:重組腺病毒質(zhì)粒pAd-HIF1α,經(jīng)PCR及酶切分析驗(yàn)證構(gòu)建正確;在HEK293中進(jìn)行HIF1α基因表達(dá)腺病毒包裝,經(jīng)反復(fù)凍融4次使細(xì)胞裂解,獲得高滴度重組腺病毒載體;通過(guò)紅色熒光蛋白(Red fluorescence protein,RFP)表達(dá),觀察到Ad-HIF1α能夠高效感染C3H10T1/2細(xì)胞,并通過(guò)PCR證實(shí)了HIF1α在C3H10T1/2細(xì)胞較對(duì)照組明顯高表達(dá);在感染Ad-HIF1α的C3H10T1/2細(xì)胞中,HIF-1α下游靶基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)明顯增高,證實(shí)表達(dá)的目的蛋白具有生物活性。結(jié)論:應(yīng)用AdEasy重組腺病毒系統(tǒng)成功構(gòu)建Ad-HIF1α,并證實(shí)其具有生物活性,為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: to construct and identify recombinant adenovirus Ad-HIF1 偽 using AdEasy recombinant adenovirus system.Methods: the coding region of HIF1 偽 gene was amplified by high fidelity PCR from EST clone, and the PCR fragment was digested by restriction endonuclease BamH I and Xba I.T4 DNA ligase was used to ligate pAdtrace-HIF1 偽 into the shuttle vector pAdtrace-TO4, which was also digested by BamH I and Xba I restriction enzyme, to construct the shuttle vector pAdtrace-HIF1 偽, and to recombine pAdtrace-HIF1 偽 and pAdEasy-1 in bacterial BJ5183.Recombinant adenovirus plasmid pAd-HIF1 偽 pAd-HIF1 偽 was digested by Pac I and transfected into E1 expression packaging cell line HEK293 for HIF1 偽 gene packaging. The recombinant adenovirus was amplified repeatedly and purified by cesium chloride density gradient centrifugation.High titer Ad-HIF1 偽 was obtained and infected stem cell line C3H10T1 / 2. The infection efficiency of C3H10T1 / 2 was determined by fluorescent protein expression. PCR and Western blot were used to verify the expression of the target gene, and the expression of downstream target gene VEGF was detected.To understand the biological activity of the target protein expressed by the vector.Results: the recombinant adenovirus plasmid pAd-HIF1 偽 was constructed correctly by PCR and restriction endonuclease analysis, and the recombinant adenovirus vector with high titer was obtained by the packaging of HIF1 偽 gene in HEK293.Through the expression of red fluorescence protein (Ad-HIF1), we found that Ad-HIF1 偽 could infect C3H10T1/2 cells highly, and the expression of HIF1 偽 in C3H10T1/2 cells was significantly higher than that in the control group by PCR.In C3H10T1/2 cells infected with Ad-HIF1 偽, the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF), the downstream target gene of HIF-1 偽, was significantly increased, which confirmed that the expressed target protein had biological activity.Conclusion: Ad-HIF1 偽 was successfully constructed by using AdEasy recombinant adenovirus system, and its biological activity was confirmed, which laid a foundation for further study.
【作者單位】： 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院;重慶市中山醫(yī)院(第十二人民醫(yī)院);重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;
【基金】：重慶科委基金基礎(chǔ)和前沿研究項(xiàng)目(cstc2013jcyjA0108)
【分類(lèi)號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：1719858