本文選題：日本血吸蟲　切入點(diǎn)：表位　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 血吸蟲病是一種世界范圍內(nèi)分布的主要公共衛(wèi)生疾病，全世界約2億多人受感染。在所有能夠引起肝纖維化的疾病中，血吸蟲病是其中的主要病因。而肝纖維化及門脈高壓是日本血吸蟲病人死亡的主要原因。 動物實(shí)驗(yàn)及人群調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重肝纖維化的形成與較強(qiáng)的Th2類免疫反應(yīng)及較弱的Th1反應(yīng)明顯相關(guān)。研究證明CD4~+Th2細(xì)胞是影響血吸蟲病肝臟免疫病理的主要因素，其中IL-13和IL-4是導(dǎo)致肝臟纖維化的主要細(xì)胞因子，IL-10、IL-12、IFN-γ在阻止慢性血吸蟲病形成嚴(yán)重肝纖維化中起重要作用，其中Th1類細(xì)胞因子IFN-γ對肝纖維化的抑制作用已經(jīng)獲得臨床研究的證實(shí)。為了探討日本血吸蟲抗原所誘導(dǎo)的Th1類免疫應(yīng)答對日本血吸蟲感染引起的肝纖維化的下調(diào)作用，為預(yù)防和治療血吸蟲病肝纖維化開辟一條新路，也對其它疾病所致的肝纖維化的免疫治療提供一定的參考資料，本研究將以往研究獲得的4個(gè)日本血吸蟲抗原T細(xì)胞表位構(gòu)建成PDDV(peptide-DNA dual vaccine)疫苗，并且從中篩選能誘導(dǎo)優(yōu)勢Th_1類免疫應(yīng)答的一種或幾種PDDV，以期進(jìn)一步用于血吸蟲感染急性期及慢性期小鼠模型，觀察其對肝纖維化的下調(diào)作用。研究包括以下主要內(nèi)容及結(jié)果： 研究內(nèi)容一：本研究室以往研究獲得4個(gè)日本血吸蟲T細(xì)胞表位P4、P6、P18和P22。首先我們設(shè)計(jì)并合成4個(gè)表位肽的編碼DNA，利用低熔點(diǎn)膠存在條件下的基因重組方法，將4種表位編碼基因分別與CpG ODN(1826)或IL-12基因(作為核酸疫苗佐劑)重組進(jìn)入pCI-neo質(zhì)粒載體，通過酶切、PCR初步鑒定獲得陽性克隆，經(jīng)過測序及序列比對證明重組克隆與設(shè)計(jì)的序列完全一致。 將合成的帶有18個(gè)賴氨酸(K18)的陽離子表位肽與帶有陰離子電荷的重組質(zhì)粒載體的HBS溶液按照一定的電荷比值進(jìn)行配比，制備成一定鹽濃度的多肽-DNA復(fù)合物溶液—PDDV(peptide-DNA dual vaccine)溶液。為了獲得高質(zhì)量的PDDV，即陽離子肽能有效包裹DNA免于被核酸酶所降解，，并且使PDDV大小為20nm左右，形態(tài)均一的顆粒，我們進(jìn)行了沉淀試驗(yàn)、阻滯試驗(yàn)、DNaseⅠ消化試驗(yàn)及電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在鹽濃度為150mM，陽離子與陰離子電荷比值(r)為4時(shí)制備的PDDV為符合以上條件的高質(zhì)量的PDDV。 研究內(nèi)容二：將4種表位肽與含有表位肽編碼基因及IL-12基因的重組質(zhì)粒按照研究一中獲得的條件制備4種PDDV：[K]_(18)P_4-pCI-P_4-IL-12、[K]_(18)P_6-pCI-P_6-IL-12、[K]_(18)P_(18)-pCI-P_(18)-IL-12、[K]_(18)P_(22)-pCI-P_(22)-IL-12及4種PDDV的等量混合物。將四種表位肽與含有相應(yīng)的表位肽基因及CpGODN1826的重組質(zhì)粒制備另外4種PDDV：[K]_(18)P_4-pCI-P_4-CpG1826、[K]_(18)P_6-pCI-P_6-CpG1826、[K]_(18)P_(18)-pCI-P_(18)-CpG1826、[K]_(18)P_(22)-pCI-P_(22)-CpG1826及4種PDDV的等量混合物。另外，使用不含表位肽基因而只含有CpG ODN或者IL-12的質(zhì)粒與K18制備的PDDV([K]_(18)-pCI-neo(?)CpG1826、[K]_(18)-pCI-neo-IL-12_(12))作為陰性對照。使用溶劑HBS作為以上所有組的空白對照免疫小鼠C57BL／6(共分13組，見后)。3次免疫后剖殺小鼠，分離、培養(yǎng)脾臟及淋巴結(jié)細(xì)胞，通過增殖試驗(yàn)觀察再次使用抗原肽刺激后淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)水平；取細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測IFN-γ及IL-4水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：動物免疫分組情況1、[K]18P4-PCI-P4-IL-12 2、[K]18P6-PCI-P6-IL-12 3、[K]18P18-PCI-P18-IL-12 4、[K]18P22-PCI-P22-IL-12 5、以上4種PDDV的等量混合物6、[K]18-PCI-neo-IL-12 7、[K]18P4-PCI-P4-CpG1826 8、[K]18P6-PCI-P6-CpG1826 9、[K]18P18-PCI-P18-CpG1826 10、[K]18P22-PCI-P22-CpG1826 11、以上4種PDDV的等量混合物12、[K]18-PCI-neo-CpG1826 13、HBS 1、第8組([K]_(18)P_6-pCI-P_6-CpG1826 PDDV免疫組)使用SWAP及表位肽[K]_(18)P_6刺激后淋巴細(xì)胞增殖水平都明顯高于陰性對照組，并且IFN-γ水平較陰性對照組明顯升高(p＜0.01，而[K]_(18)P_6刺激IL-4水平較陰性對照組低，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明[K]_(18)P_6-pCI-P_6-CpG1826 PDDV能夠較強(qiáng)誘導(dǎo)Th1類免疫應(yīng)答，P6很可能是優(yōu)勢誘導(dǎo)Th1類免疫應(yīng)答的表位。 2、使用4種表位分別與IL-12基因重組質(zhì)粒制備的PDDV混合物免疫小鼠后(第5組)，淋巴細(xì)胞增殖高于4種PDDV分別免疫組(第1、2、3、4組)的表位肽刺激的淋巴細(xì)胞增殖水平。用4種表位及含有CpG ODN重組質(zhì)粒制備的PDDV混合物免疫組(第11組)的淋巴細(xì)胞增殖水平也明顯高于四種PDDV分別免疫組。此外，第5組IFN-γ水平及IL-4升高也很明顯，以IL-4升高更為顯著，因此我們認(rèn)為幾個(gè)表位的混合PDDV的作用要較單個(gè)表位的PDDV的作用相對較強(qiáng)。而用4種表位分別與含有CpG ODN的重組質(zhì)粒制備的PDDV混合物免疫小鼠后(第11組)，淋巴細(xì)胞明顯增殖的同時(shí)，IFN-γ的產(chǎn)生明顯下降，而IL-4水平則有所升高，提示4種表位PDDV混合后可能既能誘導(dǎo)Th1類免疫應(yīng)答，又能誘導(dǎo)Th2類免疫應(yīng)答。 因此在這4種表位中有可能既有Th1類表位，又有Th2類表位，但此結(jié)論為一次實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，尚需再次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。 綜上，本研究用基因重組技術(shù)獲得分別含有P4、P6、P18、P22 4種表位基因及CpG ODN的4種重組質(zhì)粒，及此4種表位與IL-12基因的重組質(zhì)粒。通過沉淀試驗(yàn)、阻滯試驗(yàn)、DnaseⅠ消化試驗(yàn)及電鏡觀察，確定在NaCl濃度為150mM、陽離子與陰離子電荷比值為4時(shí)，可制備出形態(tài)均一、大小約為20nm、且能夠有效抵抗核酸酶的消化作用的PDDV顆粒。通過動物免疫，淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)及培養(yǎng)細(xì)胞上清中細(xì)胞因子IFN-γ及IL-4水平檢測，鑒定出表位P6為Th1表位，P6與pCI-P_6-CpG1826制備的PDDV誘導(dǎo)的Th1類應(yīng)答最為明顯。
[Abstract]:schistosomiasis is one of the major public health diseases distributed worldwide , and some 200 million people worldwide are infected . In all diseases that can cause liver fibrosis , schistosomiasis is the main cause of schistosomiasis , and liver fibrosis and portal hypertension are the main causes of the death of schistosomiasis patients in Japan .






In order to study the effect of Th1 type immune response induced by Schistosoma japonicum on liver fibrosis induced by Schistosoma japonicum infection , it has been proved that IL - 13 and IL - 4 are the main factors leading to liver fibrosis .






In this study , four epitopes of T cell epitopes of Schistosoma japonicum were designed and synthesized . Four epitope peptides were designed and synthesized . Four epitope - encoding genes were recombined with CpG ODN ( 1826 ) or IL - 12 ( as a nucleic acid vaccine adjuvant ) into pCI - neo plasmid vector .






A new solution - PDDV ( peptide - DNA dual vaccine ) was prepared by mixing cationic epitope peptide with 18 lysine ( K18 ) and recombinant plasmid vector with anionic charge according to a certain charge ratio . In order to obtain high - quality PDDV , it was found that PDDV was a high - quality PDDV which accords with the above conditions when salt concentration was 150 mM , and the ratio of cation to anionic charge ( r ) was 4 .






Four kinds of PDDV were prepared by the recombinant plasmid containing the epitope peptide gene and the IL - 12 gene . Four kinds of PDDV were prepared from the recombinant plasmids containing the corresponding epitope peptide gene and CpGODN1826 .
The levels of IFN - 緯 and IL - 4 were detected in cell culture supernatant . The results showed that the immune grouping of the animals was 1 , that K - 18P4 - PCI - P4 - IL - 12 , K - 18P18 - PCI - P18 - IL - 12 , K - 18P18 - PCI - P18 - CpG1826 - 9 , K - 18P6 - PCI - P18 - CpG1826 - 10 , K - 18P18 - PCI - P18 - CpG1826 10 , K - 18P6 - PCI - P18 - CpG1826 10 , K - 18P18 - PCI - P18 - CpG1826 10 , K - 18P18 - PCI - P18 - CpG1826 10 ,






( 18 ) P _ 6 - pCI - P _ 6 - CpG1826 PDDV was able to induce Th1 immune response .






In addition , the levels of IFN - 緯 and IL - 4 in the PDDV mixture prepared by recombinant plasmids containing CpG ODN were significantly higher than those of four PDDV groups ( Group 11 ) .






Therefore , it is possible to have both Th1 type epitopes and Th2 type epitopes in these four epitopes , but this conclusion is the result of one experiment .






In this study , four kinds of recombinant plasmids containing P4 , P6 , P18 , p22 , four epitope genes and CpG ODN were obtained by gene recombination . The results showed that when the concentration of NaCl was 150 mM , the ratio of cation to anionic charge was 4 , it was determined that the level of PDDV induced by PDDV was the most obvious when NaCl concentration was 150 mM , the ratio of cation to anionic charge was 4 . The results showed that the level of PDDV induced by PDDV was most obvious by animal immunity , lymphocyte proliferation assay and cytokine IFN - 緯 and IL - 4 levels .

【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

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本文編號：1718085