本文選題：人乳頭瘤病毒16型(HPV　切入點(diǎn)：16)　出處：《南華大學(xué)》2006年碩士論文

【摘要】：目的：構(gòu)建人乳頭瘤病毒16型(HPV 16)E6蛋白真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)／E6，研究E6蛋白瞬時(shí)高表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌及地塞米松誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步研究E6蛋白在HPV16致癌機(jī)理中的作用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增HPV16 E6基因。將PCR產(chǎn)物純化后與pUCm-T載體連接，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、雙酶切鑒定及測序分析后，亞克隆至pcDNA3.1(-)真核表達(dá)載體中；重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定后轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞，SDS-PAGE與Western-blotting鑒定E6蛋白在THP-1巨噬細(xì)胞中的表達(dá)；將pcDNA3.1(-)／E6轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24h加入終濃度為100ng／mL的LPS誘導(dǎo)，分別在誘導(dǎo)后12h、24h、48h收集培養(yǎng)上清用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β的含量，并用顯微計(jì)數(shù)法觀察E6蛋白瞬時(shí)高表達(dá)對(duì)地塞米松誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡的影響。利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS12.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果： (1)PCR產(chǎn)物克隆至pUCm-T載體上后，雙酶切及測序結(jié)果表明所克隆的目的片段與GenBank上公布的HPV16 E6基因序列完全一致，將該目的片段亞克隆至真核載體pcDNA3.1(-)上，所構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)／E6轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞，，SDS-PAGE與Western-blotting結(jié)果顯示pcDNA3.1(-)／E6可以在THP-1巨噬細(xì)胞中表達(dá)分子量約為18KD的E6蛋白。 (2)pcDNA3.1(-)／E6+LPS組培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1 β的量明顯低于巨噬細(xì)胞+LPS
[Abstract]:Aim: to construct the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 16)E6 / E6 of human papillomavirus type 16 (HPV16) and to investigate the effect of transient overexpression of E6 protein on THP-1 macrophage cytokine secretion induced by LPS and dexamethasone induced macrophage apoptosis.To further study the role of E6 protein in the carcinogenesis mechanism of HPV16.Methods: the primers were designed with Primer5.0 primer design software and HPV16 E6 gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR).After purification, PCR product was ligated with pUCm-T vector, screened by blue and white spot, identified by double enzyme digestion and sequenced, then subcloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1 ~ (-).The expression of E6 protein in THP-1 macrophages was identified by SDS-PAGE and Western-blotting, and the expression of E6 protein in THP-1 macrophages was identified by SDS-PAGE and Western-blotting. After transfection of pcDNA3.1(-)/E6 into THP-1 macrophages, the final concentration of 100ng/mL was added to LPS at 24 h after transfection, and the expression of E6 protein in THP-1 macrophages was induced by SDS-PAGE and Western-blotting.The supernatants were collected and collected at 12h ~ 24h and 48h after induction. The content of TNF- 偽 偽 -IL-1 尾 in the supernatants was detected by ELISA method, and the effect of transient overexpression of E6 protein on the apoptosis of macrophages induced by dexamethasone was observed by microscopic counting method.Statistical software SPSS12.0 is used to make statistical analysis of experimental data.Results:After the product was cloned into pUCm-T vector, the result of double enzyme digestion and sequencing showed that the cloned target fragment was identical with the sequence of HPV16 E6 gene published on GenBank, and the target fragment was subcloned into eukaryotic vector pcDNA3.1 ~ (-).The constructed eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-)/E6 was transfected into THP-1 macrophages by SDS-PAGE and Western-blotting. The results showed that pcDNA3.1(-)/E6 could express E6 protein with molecular weight of 18KD in THP-1 macrophages.The content of TNF- 偽 and IL-1 尾 in the supernatant of pcDNA3.1% E6 LPS group was significantly lower than that of macrophage LPS.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：1710733