本文選題：新生兒腦缺氧缺血性腦病　切入點：TTC染色　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：研究背景及目的：缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage. HIBD)是因腦組織部分或完全缺氧、腦血流量減少或暫停導(dǎo)致的腦損傷,最終可造成神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死。新生兒缺氧缺血性腦病(Hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)是由于圍產(chǎn)期窒息缺氧所引起的腦損傷,嚴(yán)重者可造成永久性神經(jīng)功能損害,是兒童神經(jīng)系統(tǒng)損傷的常見原因之一。缺氧缺血的主要病因是圍產(chǎn)期的窒息,窒息是由于母體和胎兒的血液循環(huán)障礙和氣體交換障礙,導(dǎo)致血氧的濃度降低。宮內(nèi)窒息的發(fā)生率占50%,分娩過程中窒息率占了40%,其他原因占了10%。由于新生兒腦代謝很旺盛,全身耗氧量的一半為腦耗氧量并且腦內(nèi)的糖原含量很少,所以氧和葡萄糖全都要靠腦部血液循環(huán)提供,當(dāng)機(jī)體缺氧缺血,腦組織會發(fā)生以下改變：1、能量代謝會發(fā)生障礙：由于缺氧時候,腦組織的酵解力增強(qiáng)5-10倍,就會引發(fā)代謝性的酸中毒；2、通氣功能的改變：二氧化碳貯留,使PaCO2增強(qiáng),就會引發(fā)呼吸性的酸中毒；3、腦內(nèi)的無氧代謝使ATP的產(chǎn)生大量降低,一種原因是因為能量的來源不充足,使腦的氧化代謝受到了非常大的損害,神經(jīng)元大量壞死。而另一種原因是鈉泵轉(zhuǎn)運功能障礙,腦細(xì)胞內(nèi)部的氯化鈉水平上升,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生水腫現(xiàn)象；4、腦部的微血管缺氧及血流減少,則引起腦的缺血,并引起血管的通透性的升高進(jìn)而產(chǎn)生血管源性的腦水腫：5、當(dāng)缺氧缺血后引起再灌注的損傷、鈣離子超負(fù)荷和氧自由基的增多,氨基酸興奮、并且大量釋放各種細(xì)胞因子,誘發(fā)一系列的復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng),造成神經(jīng)元損傷。該病的病理基礎(chǔ)是缺氧缺血性損傷。缺氧主要會引起腦水腫及神經(jīng)元壞死,缺血主要引起腦血管梗塞以及白質(zhì)軟化。臨床表現(xiàn)：1、足月新生兒、具有臨床上可以診斷的宮內(nèi)窘迫史或著新生兒的產(chǎn)時窒息的情況；2、出現(xiàn)程度不同的意識改變,輕者會出現(xiàn)激惹或者嗜睡,重者出現(xiàn)昏迷；3、患兒的前囟飽滿、頭圍會變大、骨縫有分離,出現(xiàn)腦水腫的表現(xiàn)；4、肌張力的改變；5、驚厥：中、重癥多見,驚厥可以表現(xiàn)為陣攣型樣表現(xiàn)和強(qiáng)直性肌陣攣型表現(xiàn),發(fā)作次數(shù)不規(guī)律,一般會在在生后24小時發(fā)作,發(fā)作者在24小時以內(nèi)的后遺癥發(fā)生率明顯升高;6、原始反射的異常：比如擁抱反射活動會異�；钴S、有時則會減弱或消失。吸吮反射活動有時減弱或者消失；7、重癥患兒會出現(xiàn)呼吸衰竭,常常伴有有呼吸節(jié)律不齊、呼吸暫時停止、以及眼球的震顫、瞳孔大小的改變等腦干損傷的表現(xiàn),重度表現(xiàn)的HIE患兒即使可以存活下來,也會常�；加兄橇φ系K、腦癱、癲癇等嚴(yán)重的后遺癥。[4，，5]當(dāng)前在臨床上針對于HIE的治療方法主要是護(hù)理及支持療法。一直以來,探索和研發(fā)治療HIE的有效的藥物,是新生兒科醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的非常緊迫的任務(wù)。近幾年來,間充質(zhì)干細(xì)胞不論是在胚胎中或者是在成年個體的神經(jīng)系統(tǒng)中的發(fā)現(xiàn)以及體外培養(yǎng)成功為缺氧缺血性腦病的細(xì)胞移植治療和基因治療,提供了新的方法在了解這些治療方案療效及其作用機(jī)制的研究中,HIE動物模型起到了非常重要的作用。在高原地區(qū),大氣氧分壓較低,由于高原低氧的影響,新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)在高原地區(qū)發(fā)病率比較高。本實驗采用高原低壓環(huán)境模擬倉結(jié)合大鼠游泳運動的方法制備高原地區(qū)新生兒缺氧缺血性腦病大鼠模型,觀察其行為學(xué)、腦組織病理變化、腦TTC染色和電鏡下紅細(xì)胞形態(tài)觀察,為HIE在高原地區(qū)的臨床研究做基礎(chǔ)實驗準(zhǔn)備。方法：將SD新生大鼠(10日齡)32只,隨機(jī)分為4組：對照組為A組,實驗組：B組(2000m組)、C組(4000m組)、D組(6000m組)。對照組大鼠在屏障環(huán)境中飼養(yǎng),實驗組大鼠置于高原低壓環(huán)境模擬倉結(jié)合運動的方式在艙內(nèi)游泳槽進(jìn)行60 min/d的游泳運動,且在高原低壓環(huán)境模擬艙內(nèi)生活時間每天不少于20小時。每組大鼠分別在第3、7、11、15d用Zea Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行行為學(xué)評分并且于第15d采集靜脈血,在掃描電鏡下觀察紅細(xì)胞形態(tài)。每組處死后取腦組織進(jìn)行HE染色和TTC染色。模型制作成功后,分為3組即對照組：8只：HIE+PBS組(模型組)：8只,先制成HIE模型,然后給予PBS作為安慰治療；HIE+MSC組(治療組)：8只,先制成HIE模型,然后給予MSC治療。分別于干預(yù)后第5、7、14、21天進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)檢測(Rotarod Test旋轉(zhuǎn)實驗和Morris水迷宮測試)。21日后處死采用組織切片HE染色,觀察新生大鼠腦損傷的病理變化。結(jié)果：1、神經(jīng)病學(xué)評分對照組行為正常,在行為學(xué)評分中為0分,而實驗組大鼠行為學(xué)異常,主要表現(xiàn)為一側(cè)肢體感覺和運動功能障礙和平衡功能的異常。實驗組大鼠評分隨海拔升高而升高,行為異常程度與海拔高度呈正相關(guān)。并且實驗組大鼠在第3、7、11、15d行為學(xué)評分逐漸升高,這一數(shù)據(jù)表明長期生活中缺氧環(huán)境中會使腦損傷程度日趨加重,實驗表明對照組與各實驗組差異有顯著性意義p0.05)海拔6000m組與對照組比較差異非常顯著(p＜0.01)。2、腦組織病理學(xué)改變對照組腦組織神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞大小、外形正常,未出現(xiàn)腦水腫;在海拔2000m大腦皮質(zhì)輕度萎縮,神經(jīng)元細(xì)胞輕度水腫,膠質(zhì)細(xì)胞輕度增生：在海拔4000m大腦皮質(zhì)中度萎縮,神經(jīng)元細(xì)胞中度水腫,膠質(zhì)細(xì)胞中度增生；在海拔6000m室管膜細(xì)胞重度水腫。3、TTC染色結(jié)果TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)是脂溶性光敏感復(fù)合物,它是呼吸鏈中吡啶—核苷結(jié)構(gòu)酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體,與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)而呈紅色,而缺氧缺血組織內(nèi)脫氫酶活性下降,不能反應(yīng),故不會產(chǎn)生變化呈蒼白[16]。對照組TTC染色結(jié)果為紅色,未出現(xiàn)缺氧缺血表現(xiàn)；海拔2000m出現(xiàn)輕度改變,大腦皮質(zhì)出現(xiàn)小片蒼白；海拔4000m大腦皮質(zhì)區(qū)可明顯看見蒼白區(qū)域；海拔6000m接近一半出現(xiàn)蒼白區(qū)。利用Image-Pro Plus做出海拔2000m組腦缺氧面積為26.6%,海拔4000m組腦缺氧面積為34.3%,海拔6000m組腦缺氧面積為56.6%,而對照組則為正常。4、電鏡下紅細(xì)胞在掃描電鏡下可以看見對照組紅細(xì)胞呈雙凹圓盤狀,在海拔2000m下電鏡表現(xiàn)為輕度改變呈帽狀結(jié)構(gòu)；在海拔4000m下表現(xiàn)為不規(guī)則形；在海拔6000m下表現(xiàn)為鋸齒狀,部分紅細(xì)胞會出現(xiàn)空洞,崩解。間充質(zhì)干細(xì)胞給予治療：5、Rotarod Test結(jié)果顯示造模后第5天模型組與治療組大鼠在轉(zhuǎn)輪中堅持時間明顯下降,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；造模后第7、14、21天,模型組與治療組大鼠在轉(zhuǎn)輪中堅持時間有升高趨勢,其中治療組升高趨勢明顯高于模型組(P0.05),第21天模型組與治療組大鼠在轉(zhuǎn)輪中堅持時間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。6、Morris水迷宮結(jié)果顯示3組大鼠的逃避潛伏期顯示隨訓(xùn)練天數(shù)增加而逃避時間逐漸縮短,前5天的總體學(xué)習(xí)成績的組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。第7天開始治療組時間逐漸縮短,第21天治療組與模型組大鼠的逃避潛伏期在各個時間點的差異非常顯著。7、病理結(jié)果：模型組大鼠出現(xiàn)海馬區(qū)神經(jīng)元水腫、核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)不清、空泡形成等病理變化，而治療組病理損傷明顯減輕。結(jié)論：本研究采用高原低壓環(huán)境模擬倉結(jié)合運動模擬高原環(huán)境制作新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)的模型,該模型穩(wěn)定、可靠,比其他方法更符合缺血缺氧腦損傷的發(fā)病機(jī)理,與臨床貼近,可用于相關(guān)研究。間充質(zhì)干細(xì)胞治療后發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)大鼠缺血腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R742;R-332

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本文編號：1710281