發(fā)布時(shí)間：2018-04-01 01:28

  本文選題：高遷移率族蛋白B1　切入點(diǎn)：晚期糖基化終末產(chǎn)物受體　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box-l, HMGB1)是一種DNA結(jié)合蛋白,因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)的快速遷移而得名,是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的唯一的能在細(xì)胞外誘導(dǎo)細(xì)胞因子和活化炎癥細(xì)胞的核內(nèi)蛋白。HMGB1具有3個(gè)結(jié)構(gòu)域,即A、B、C區(qū),A和B區(qū)主要構(gòu)成HMGB1的非特異性DNA結(jié)合區(qū);C區(qū)可與其它蛋白相互作用來(lái)調(diào)節(jié)HMGB1與DNA的親和力。HMGB1分布十分廣泛,在多種器官組織(如淋巴組織、腦、肝、肺、心、脾、腎等)的細(xì)胞中均有表達(dá),而其表達(dá)水平又與細(xì)胞分化程度相關(guān),未分化細(xì)胞的表達(dá)水平較高。作為危險(xiǎn)信號(hào)和炎癥介質(zhì),HMGB1的產(chǎn)生較TNF-α和IL-1等早期細(xì)胞因子晚,且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),故有“晚期炎癥介質(zhì)”之稱(chēng),它通過(guò)兩種不同的途徑釋放至細(xì)胞外:活化炎癥細(xì)胞的主動(dòng)分泌和壞死細(xì)胞的被動(dòng)釋放。越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道,HMGB1是引起急性炎癥反應(yīng)的重要因素,HMGB1也可在胞漿內(nèi)表達(dá)或分泌到細(xì)胞外,與膿毒癥、肺動(dòng)脈高壓、肺炎癥損傷、內(nèi)毒素血癥、關(guān)節(jié)炎、滑膜炎等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。因此,尋找針對(duì)HMGB1的抑制劑,而有效的降低炎癥的致死率,是本課題的要解決的重要問(wèn)題。 與HMGB1結(jié)合的高親和力的配體是晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE),RAGE是在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的,屬免疫球蛋白超家族成員,由400多個(gè)氨基酸組成,相對(duì)分子質(zhì)量約35 000,分為胞外段、跨膜段和胞內(nèi)段。其胞外部分包含了一個(gè)“V”型區(qū)和兩個(gè)“C”型區(qū),與HMGB1結(jié)合的主要部位位于N端的“V”型區(qū)。RAGE廣泛分布于單核/巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞表面,與HMGB1結(jié)合以后會(huì)出現(xiàn)上調(diào)表達(dá),啟動(dòng)一個(gè)正反饋環(huán),產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、對(duì)某些干細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用、誘導(dǎo)血管粘附分子產(chǎn)生,使細(xì)胞持續(xù)處于激活狀態(tài),最終導(dǎo)致組織損傷。 α-黑素細(xì)胞刺激素(alpha-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)是一種內(nèi)源性神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)肽,通過(guò)結(jié)合黑皮質(zhì)素受體(Melanocortin Receptor MCR)來(lái)發(fā)揮退熱、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)證明α-MSH對(duì)一些早期致炎因子起到了一定的抑制作用,但由于其對(duì)MC1-R和MC3-R有較高的選擇性,對(duì)MC4-R和MC5-R的親和力很低,而不能高效、持久、穩(wěn)定地發(fā)揮作用。雖然[Nle4,D-Phe7]α-MSH(NDP-MSH)是目前較為理想的α-MSH類(lèi)似物,具備了高效、作用持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、蛋白水解酶抵抗性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、可溶性好等優(yōu)點(diǎn),抗炎效果也優(yōu)于α-MSH,但也是由于其受體的選擇性不高,并且還有明顯的色素沉著作用,有可能影響其它生理功能,故臨床應(yīng)用受到限制。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的α-黑素細(xì)胞刺激素新型類(lèi)似物——多肽39是基因工程、蛋白質(zhì)工程與化學(xué)修飾相結(jié)合的新生產(chǎn)物,這種利用軟件InsightⅡ?qū)Ζ?MSH結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾,合成新型的類(lèi)似物不僅對(duì)受體(MC1-R和MC5-R)具有很強(qiáng)的選擇性,而且對(duì)實(shí)驗(yàn)性?xún)?nèi)毒素休克有顯著的保護(hù)作用,能有效的減少肺、心、肝、腎、腦等臟器的炎癥反應(yīng),這些特性為此新型化合物的臨床應(yīng)用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。本課題的創(chuàng)新點(diǎn)在于,第一、α-MSH對(duì)于HMGB1及其受體RAGE是否具有調(diào)控作用,未見(jiàn)有人報(bào)道,我們從基因、蛋白兩個(gè)方面做了大量實(shí)驗(yàn),證實(shí)α-MSH可下調(diào)HMGB1及RAGE的表達(dá)。第二、多肽39是根據(jù)α-MSH結(jié)構(gòu)由本實(shí)驗(yàn)室自主合成的全新的多肽化合物。第三、經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)多肽39對(duì)HMGB1及其受體RAGE的下調(diào)作用強(qiáng)于α-MSH及NDP-MSH,有效的控制了炎癥的發(fā)生。 第一部分α-黑素細(xì)胞刺激素及其類(lèi)似物對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠表達(dá)高遷移率族蛋白1及其受體的調(diào)控作用 首先對(duì)HMGB1及其受體RAGE在內(nèi)毒素血癥小鼠模型中的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè),將BALB/c小鼠隨機(jī)分成4組(A～D組),每組9只,A組為PBS對(duì)照組,其余3組參考Galanos的方法,小鼠腹腔內(nèi)注射(ip)LPS(25μg/kg)和D-Gal(100 mg/kg)(PBS稀釋)建立內(nèi)毒素血癥小鼠模型,分別于18 h(B組)、24 h(C組)、32 h(D組)后,取腦、肺、肝、腎、脾等組織,采用RT-PCR和Western Blot方法從基因和蛋白水平檢測(cè)了HMGB1及其受體RAGE的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:HMGB1及其受體RAGE均在(ip)LPS 18 h有所表達(dá),24 h表達(dá)到高峰,32 h HMGB1的表達(dá)量仍維持在較高水平,而RAGE的表達(dá)量在32 h明顯減少,與對(duì)照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01),并且HMGB1及其受體RAGE在肺、肝的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其它組織。在此基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)又觀(guān)察了α-MSH及其類(lèi)似物NDP-MSH和多肽39調(diào)控HMGB1及其受體RAGE表達(dá)的時(shí)效關(guān)系。運(yùn)用已建立的內(nèi)毒素血癥小鼠模型,按照給藥時(shí)間不同,將BALB/c小鼠隨機(jī)分成5組(A～E組),每組9只,A組為PBS對(duì)照組,B組為L(zhǎng)PS對(duì)照組,C組、D組、E組小鼠分別在(ip) LPS后1 h、2 h、3 h注射2.5 mg/kg的三種多肽,24 h后處死小鼠,取肺、肝等組織,應(yīng)用RT-PCR和Western Blot的方法鑒定。結(jié)果顯示:在注射LPS后2 h之內(nèi)分別給予三種多肽,能明顯抑制HMGB1和RAGE的表達(dá),與對(duì)照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。α-MSH使HMGB1及其受體RAGE的表達(dá)量減少35%～40%,NDP-MSH使HMGB1及其受體RAGE的表達(dá)水平下降55%～60%,多肽39可使HMGB1的產(chǎn)生降低60%～65%,作用優(yōu)于α-MSH和NDP-MSH。 第二部分α-黑素細(xì)胞刺激素及其類(lèi)似物在體外對(duì)U937細(xì)胞表達(dá)高遷移率族蛋白1及其受體的調(diào)控作用 用含有10%小牛血清的1640培養(yǎng)基,在37℃,5%CO2的條件下培養(yǎng)人單核細(xì)胞系U937細(xì)胞。觀(guān)察體外培養(yǎng)的U937細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后表達(dá)HMGB1及其受體RAGE的動(dòng)態(tài)變化。根據(jù)收集細(xì)胞的時(shí)間不同,將其分為5組,用100 ng/ml LPS刺激U937細(xì)胞,分4個(gè)時(shí)間段(6 h, 12 h, 18 h, 24 h)收集細(xì)胞,提取蛋白和mRNA,應(yīng)用Western blot和RT-PCR的方法測(cè)定HMGB1和RAGE的表達(dá)。結(jié)果顯示:100ng/ml LPS刺激U937細(xì)胞18 h HMGB1表達(dá)到高峰,其受體RAGE表達(dá)高峰期早于HMGB1,但在18 h仍能維持較高水平,與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01),故我們選擇18 h做為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)時(shí)間點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上,對(duì)α-MSH及類(lèi)似物調(diào)控U937細(xì)胞表達(dá)HMGB1及其受體RAGE的時(shí)效關(guān)系進(jìn)行了檢測(cè)。將U937細(xì)胞接種于24孔板,按照給藥時(shí)間不同,分為5組(A～E組),A組為PBS對(duì)照組,B組為L(zhǎng)PS對(duì)照組, C組、D組、E組為100ng/ml LPS刺激1 h、2 h、3 h后分別將濃度為10-7M的三種多肽加入到培養(yǎng)體系中,18 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示:細(xì)胞經(jīng)100 ng/ml LPS刺激后,于2 h之內(nèi)給藥,HMGB1及其受體RAGE的表達(dá)量明顯減少,并且與α-MSH、NDP-MSH相比,多肽39的抑制作用更強(qiáng)(P0.05),與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本一致。另外,本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察了α-MSH及類(lèi)似物對(duì)U937細(xì)胞表達(dá)HMGB1及其受體RAGE表達(dá)調(diào)控的量效關(guān)系。將U937細(xì)胞接種于24孔板,依據(jù)三個(gè)濃度梯度(10-5M、10-7M、10-9M)將細(xì)胞分成五組(A～E組),A組為空白對(duì)照組,B組為L(zhǎng)PS對(duì)照組,C組、D組、E組用100 ng/ml LPS刺激細(xì)胞1 h內(nèi)將10-5M、10-7M、10-9M三種濃度的三種多肽分別加入到培養(yǎng)體系中,18 h后收集細(xì)胞,運(yùn)用Western blot和RT-PCR的方法從基因、蛋白兩個(gè)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示:10-5M、10-7M的多肽39和NDP-MSH能有效下調(diào)HMGB1及其受體RAGE的表達(dá),而α-MSH在10-7M時(shí)作用效果比較理想。 目前HMGB1與RAGE結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要涉及兩條通路。一條涉及Rac和Cdc42途徑,導(dǎo)致細(xì)胞骨架重建;另一條涉及Ras-MAPK途徑和隨后核因子NF-κB移位介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。另有實(shí)驗(yàn)顯示,抑制HMGB1與RAGE的相互作用能阻斷p44/p42、p38、SAP/JNK MAPK和NF-κB活化。HMGB1介導(dǎo)的平滑肌移位能使MAPK途徑激活且使磷酸化的ERK1和ERK2移位到細(xì)胞核。因此,我們結(jié)合LPS影響的信號(hào)途徑選擇其中二個(gè)重要的相關(guān)信號(hào)分子,即p38及NF-κB,初步探索α-MSH及其兩個(gè)類(lèi)似物對(duì)HMGB1與RAGE涉及的信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。Western blot的結(jié)果顯示,α-MSH及相關(guān)類(lèi)似物明顯抑制了p38的表達(dá)。另外,三種多肽對(duì)LPS誘導(dǎo)的NF-κB的表達(dá)也有顯著的下調(diào)作用。本研究結(jié)果展示了HMGB1-RAGE信號(hào)途徑與LPS信號(hào)途徑之間存在交互作用,對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)機(jī)體的炎癥反應(yīng)機(jī)制及其精細(xì)調(diào)控,以及新型治療手段的發(fā)現(xiàn)提供了潛在新思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R341

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1693374