本文選題：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞　切入點：分離　出處：《重慶大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 血管疾病是危及人類健康的常見疾病之一,其治療手段之一是血管移植術(shù)。因此血管移植物的來源就成為人們關(guān)注的重要課題。目前臨床上應(yīng)用的血管移植物主要有自體血管、異體血管和人工材料血管三種,但不能滿足臨床需求。 組織工程學(xué)的興起為血管移植物的來源提供了一條嶄新的思路。組織工程化的血管研究中種子細(xì)胞制取、培養(yǎng)和種植是其關(guān)鍵性的步驟。 血管發(fā)生的主體是內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,ECs)。但內(nèi)皮細(xì)胞屬于成熟細(xì)胞,其分裂增殖能力不強(qiáng),獲得的細(xì)胞數(shù)量有限,且細(xì)胞還存在去分化的傾向,因此必須尋找新的種子細(xì)胞。 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是起源于中胚層的多能干細(xì)胞,具有高度增殖、自我更新的能力及多向分化潛能。MSCs因取材方便,損傷輕微,對健康無害;取自自體,和無倫理、移植免疫排斥問題;另外它還可以體外大量培養(yǎng)擴(kuò)增、易定向誘導(dǎo)分化以及外源基因易植入表達(dá)等優(yōu)勢,有望成為組織工程化血管種子細(xì)胞的主要來源。 然而,目前MSCs的分離、純化、鑒定及體外培養(yǎng)尚無統(tǒng)一方案,體外培養(yǎng)生長較慢,長期培養(yǎng)還有自動分化的可能。另外,MSCs雖然具有內(nèi)皮細(xì)胞的某些表型,但有關(guān)MSCs在血管組織中的作用及其與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的關(guān)系還需作進(jìn)一步的研究。 因此,如何在體外得到大量純化的MSCs,以及在體外條件下誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞(endothelial-like cells,ELCs)并探討其發(fā)生的機(jī)制,就成為組織工程血管種子細(xì)胞研究的基礎(chǔ)。為此,本實驗通過建立大鼠骨髓MSCs(rat bone marrow MSCs, rBMMSCs)體外培養(yǎng)體系,探討在體外條件下,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,b-FGF)對MSCs分化為ELCs的可行性,期望為血管組織工程基礎(chǔ)研究提供資料。 方法 本實驗采用1.073g/mL Percoll密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法,體外培養(yǎng)rBMMSCs。采用24小時后貼壁的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),以后每隔3天換液一次。待細(xì)胞80%融合后,消化傳代,使之逐漸純化。研究在體外培養(yǎng)條件下,rBMMSCs細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、生長曲線、細(xì)胞周期、表型等生物學(xué)特征。免疫組化法和流式細(xì)胞儀檢測CD34, CD44、CD29和CD31的表達(dá)。用細(xì)胞誘導(dǎo)液(10ng/mL VEGF、2ng/mL b-FGF)誘導(dǎo)其向ELCs分化,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),激光掃描共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、免疫組化檢測誘導(dǎo)細(xì)胞CD34、CD31、VE-cadherin的表達(dá)以及ELCs的功能,即對乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)攝取和與荊豆凝集素(UEA-1)的結(jié)合。 結(jié)果 1、采用Percoll密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法所培養(yǎng)的rBMMSCs呈長梭形,胞核圓形或橢圓形,位于細(xì)胞中央;免疫組化檢測的結(jié)果為CD29、CD44陽性,CD34陰性;流式細(xì)胞檢測rBMMSCs不表達(dá)ELCs的CD31標(biāo)記。 2、從傳代細(xì)胞生長曲線可見:第1~2d為細(xì)胞生長潛伏期,第3~7d為對數(shù)增長期,8d以后細(xì)胞的生長進(jìn)入平臺期;符合干細(xì)胞的生長規(guī)律。 3、透射電鏡結(jié)果顯示:rBMMSCs有兩種不同的形態(tài)結(jié)構(gòu),其中體積較小、核質(zhì)比大、胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器稀少者,為幼稚的rBMMSCs,表明它是處于未分化或分化較低狀態(tài)的干細(xì)胞。 4、細(xì)胞周期分析顯示:在一定范圍內(nèi),隨著傳代的進(jìn)行,處于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量增多,說明所培養(yǎng)的rBMMSCs絕大部分處于非增殖狀態(tài)。 5、rBMMSCs在VEGF和b-FGF的刺激下,細(xì)胞形態(tài)逐漸縮短,部分細(xì)胞呈扁平形或圓形,可見串珠樣結(jié)構(gòu)和管狀結(jié)構(gòu)。纖連蛋白能顯著促進(jìn)管狀結(jié)構(gòu)的形成。6、分化細(xì)胞免疫表型為:CD31、VE-cadherin、CD34陽性,具有ELCs的功能特點:攝取Dil-ac-LDL并能結(jié)合UEA-1。 結(jié)論: 本論文在前人工作的基礎(chǔ)上,通過體外分離、純化和鑒定rBMMSCs,建立了一套較合理的間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的技術(shù)方案,用此方案可獲得rBMMSCs。進(jìn)一步,用VEGF生長因子對rBMMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),從形態(tài)、表型和功能等三個方面對其表征,rBMMSCs的確可以分化為ELCs,并初步判定這種ELCs具有向血管生成的潛力。因此本研究工作可為下一步進(jìn)行的人工血管構(gòu)建,尤其是所需種子細(xì)胞的來源提供重要的實驗參考依據(jù)。
[Abstract]:Vascular disease is one of the most common diseases threatening human health . One of the treatments is vascular transplantation . Therefore , the source of vascular graft has become an important subject of concern . At present , there are three kinds of vascular grafts in clinical application , such as autologous blood vessels , allograft vessels and artificial blood vessels , but do not meet the clinical needs .





The rise of tissue engineering provides a brand - new idea for the origin of vascular grafts . The preparation , cultivation and planting of seed cells in tissue engineering are critical steps .





The main body of angiogenesis is endothelial cells ( ECs ) . However , the endothelial cells belong to mature cells , and their cell division and proliferation ability are not strong , the number of cells obtained is limited , and the cells also have the tendency of dedifferentiation , so it is necessary to find new seed cells .





Mesenchymal stem cells ( MSCs ) are multipotent stem cells derived from mesoderm , and have the abilities of high proliferation and self - renewal and multi - directional differentiation potential . MSCs can be taken as the main source of tissue engineering vascular seed cells because of their convenience , mild injury and no harm to health .





However , MSCs can be isolated , purified , identified and cultured in vitro . In addition , MSCs have some phenotypes of endothelial cells , but the relationship between MSCs in vascular tissue and their relationship with vascular endothelial cells is further studied .





Therefore , how to obtain a large amount of purified MSCs in vitro , and to induce differentiation into endothelial - like cells ( ELCs ) in vitro and to explore the mechanism of their occurrence is the basis for the study of vascular seed cells in tissue engineering . To this end , the feasibility of differentiation into ELCs by vascular endothelial growth factor ( VEGF ) and basic fibroblast growth factor ( b - FGF ) in vitro is discussed .





method





The expression of CD34 , CD44 , CD29 and CD31 was detected by immunohistochemistry and flow cytometry . The expression of CD34 , CD44 , CD29 and CD31 was detected by immunohistochemistry and flow cytometry . The expression of CD34 , CD44 , CD29 and CD31 was detected by immunohistochemistry and flow cytometry . The expression of CD34 , CD31 , VE - cadherin and the function of ELCs were detected by immunohistochemistry and flow cytometry .





Results





1 . The rBMMSCs cultured by the method combined with Perfluorodensity gradient centrifugation and adherent culture were spindle - shaped , round or oval in nucleus , and located in the center of the cell ; the results of immunohistochemistry were CD29 , CD44 - positive and CD34 - negative ; and the flow cytometry showed that the rBMMSCs did not express the CD31 markers of ELCs .





2 . From the growth curve of the passaging cells , the growth latency of the cells was observed in the 1st to 2nd days , and the growth of the cells in the 3rd to 7th days was logarithmic , and the growth of the cells into the stage after 8d . The growth of the stem cells was met .





3 . Transmission electron microscopy showed that rBMMSCs had two different morphological structures , of which the volume was small , the nuclear mass ratio was large , the organelle in the cytoplasm was sparse , and the immature rBMMSCs showed that it was a stem cell which was in the undifferentiated or poorly differentiated state .





4 . Cell cycle analysis showed that in a certain range , the number of cells in G0 / G1 phase increased with the generation of passages , indicating that the majority of cultured rBMMSCs were in a non - proliferative state .





5 . Under the stimulation of VEGF and b - FGF , the morphology of the cells was gradually shortened , and some cells were flattened or round , visible tandem - like structure and tubular structure .





Conclusion :





rBMMSCs were isolated , purified and identified on the basis of the previous work , and a set of more reasonable techniques for the in vitro culture of mesenchymal stem cells was established .

【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R329

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本文編號：1692616