本文選題：炭疽　切入點：嵌合抗體　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2007年碩士論文

【摘要】： 炭疽是嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病，接種炭疽疫苗是預(yù)防炭疽的有效手段，但是疫苗產(chǎn)生保護性免疫需要一定時間，在疾病流行和某些突發(fā)事件發(fā)生時無法提供有效的緊急免疫防護。而中和性抗體作為被動免疫制劑可以彌補炭疽疫苗的不足，直接提供有效的保護。 因此，本研究選擇在中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細(xì)胞中表達(dá)具有中和活性的抗炭疽芽胞桿菌重組保護性抗原(recombinant protective antigen，rPA)的嵌合抗體，為炭疽的治療提供被動免疫制劑。 首先克隆3株具有中和活性的抗炭疽芽胞桿菌重組保護性抗原(rPA)的鼠源單克隆抗體(monoclonal antibody，nAb)的V_L和V_H基因。對獲得的可變區(qū)基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)的分析，初步判斷為鼠的免疫球蛋白(Immunoglobin，Ig)基因。 為了快速驗證獲得的可變區(qū)基因是否具有生物學(xué)活性，將5E1和4B2的V_L、V_H基因分別通過(Gly4Ser)_3的連接肽融合構(gòu)建了scFv基因，在大腸桿菌中表達(dá)并純化了單鏈抗體，實驗表明scFv能夠與rPA特異結(jié)合，且在細(xì)胞模型上具有中和活性，為表達(dá)具有中和活性的嵌合抗體奠定了實驗基礎(chǔ)。 為表達(dá)全分子嵌合抗體，通過重疊延伸PCR技術(shù)將5E1的V_H、V_L基因分別與人IgG1亞類的C_H和C_K基因融合，構(gòu)建了完整人-鼠嵌合抗體基因。將人-鼠嵌合抗體基因克隆到表達(dá)載體的多克隆位點(mutiple cloning site，MCS)，構(gòu)建了嵌合抗體的表達(dá)質(zhì)粒。將構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO／dhfr~-(DG44)細(xì)胞，經(jīng)氨甲喋呤(Methotrexate，MTX)初步加壓(MTX濃度為5×10~(-8)mol／L)篩選，獲得最高表達(dá)量為18mg／L的細(xì)胞株。對此細(xì)胞株擴大培養(yǎng)并純化嵌合抗體。純化的嵌合抗體在非還原SDS-PAGE中表現(xiàn)為一條約150kD的帶，在還原SDS-PAGE中表現(xiàn)為一條約50kD和一條約25kD的帶；Western印跡結(jié)果顯示，全分子蛋白和重鏈(heavy chain，H鏈)分子均可與羊抗人IgG Fc發(fā)生特異性免疫反應(yīng)；全分子蛋白和還原后的輕鏈(light chain，L鏈)重鏈(high chain，H鏈)分子均可與羊抗人IgG發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。ELISA檢測結(jié)果顯示，純化的嵌合抗體與rPA發(fā)生反應(yīng)，，說明表達(dá)的嵌合抗體保留了親本鼠源mAb的抗原結(jié)合活性。在毒素作用的J774A．1細(xì)胞模型和Fisher 344大鼠模型上，純化的嵌合抗體表現(xiàn)出與鼠源mAb 5E1大致相同的中和活性。 以上實驗結(jié)果表明，制備的嵌合抗體能作為被動保護制劑，在炭疽的治療上具有潛在應(yīng)用價值。
[Abstract]:Anthrax is a serious threat to human health infectious disease, anthrax vaccine is an effective means to prevent anthrax, but the vaccine production of protective immunity takes some time, The neutralizing antibody as a passive immune agent can make up for the deficiency of anthrax vaccine and provide effective protection directly. Therefore, in order to provide passive immunoassay for anthrax treatment, we selected chimeric antibodies against recombinant protective antigens of Bacillus anthracis expressed in Chinese hamster ovaryary Cho cells of Chinese hamster ovary. The VL and VSP genes of three murine monoclonal antibodies (McAb) against Bacillus anthracis, recombinant protective antigen rPA), were first cloned. Bioinformatics analysis of the obtained variable region gene sequences was carried out. It was preliminarily identified as immunoglobulin (immunoglobin) IgA gene in mice. In order to quickly verify the biological activity of the obtained variable region gene, scFv gene was constructed by fusion of 5E1 and 4B2's VL / VH gene via Gly4Serap3 ligand peptide respectively, and the single chain antibody was expressed and purified in E. coli. The results showed that scFv could specifically bind to rPA and had neutralization activity in cell model, which laid the experimental foundation for the expression of chimeric antibody with neutralizing activity. In order to express the whole molecular chimeric antibody, the 5E1's V _ S / V _ S _ L gene was fused with the human IgG1 subclass C _ (th) and C _ (K) genes by overlapping extension PCR technique, respectively. A complete human-mouse chimeric antibody gene was constructed. The human mouse chimeric antibody gene was cloned into the polyclonal site of the expression vector, and the expression plasmid of chimeric antibody was constructed. The constructed expression plasmid was transfected into Cho / dhfr-mG44 cells. A cell line with the highest expression of 18mg/L was obtained by screening with methotrexate methotrexate MTX at a concentration of 5 脳 10 ~ (-8) mol 路L ~ (-1). The chimeric antibody was cultured and purified in this cell line. The purified chimeric antibody was expressed as a treaty 150kD band in non-reduced SDS-PAGE. The results of Western blotting with a treaty 50kD and a treaty 25kD in the reductive SDS-PAGE showed that the whole protein and heavy chain heavy chain chain H chain could react specifically with sheep anti-human IgG FC. The whole molecular protein and the reduced light chain light chain L chain) heavy chain and high chain chain H) could react with sheep anti-human IgG. The results of Elisa showed that the purified chimeric antibody reacted with rPA. The results showed that the expressed chimeric antibody retained the antigen-binding activity of the parental murine mAb, and the purified chimeric antibody exhibited approximately the same neutralization activity as the murine mAb 5E1 in the J774A.1 cell model and the Fisher 344 rat model. The results show that the chimeric antibody can be used as a passive protective agent and has potential application value in the treatment of anthrax.
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

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本文編號：1691183