本文選題：幽門螺桿菌　切入點：表位疫苗　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍的主要病原菌,與胃癌、胃粘膜相關(guān)性淋巴組織淋巴瘤密切相關(guān),已被世界衛(wèi)生組織列為Ⅰ類致癌因子。目前臨床治療H. pylori感染主要方法為聯(lián)合應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑和抗生素的療法,雖然在一定程度上能清除H. pylori,但患者對藥物的依從性差、抗生素耐藥菌株不斷出現(xiàn)、再感染的發(fā)生及藥物的不良反應(yīng)等,這都使臨床藥物治療受到限制。有效的預(yù)防性和治療性H. pylori疫苗可以克服上述藥物治療H.pylori的不足,被認為是控制H. pylori感染的最有前景的方法,是根除H. pylori感染的希望。 基于表位疫苗設(shè)計(Epitope-based Vaccine Design,EBVD)的策略被認為是第四代疫苗,其著眼點是免疫應(yīng)答的功能單位——表位。表位疫苗明顯的優(yōu)勢是設(shè)計靈活、針對性強,選擇優(yōu)勢表位進行合理的組合設(shè)計,能夠誘導(dǎo)高效、安全、特異的免疫應(yīng)答。近年來,表位疫苗已經(jīng)成為研制感染性疾病、惡性腫瘤以及自身免疫性疾病等疫苗設(shè)計的新方向,并取得顯著進展。H.pylori自然感染可通過免疫偏差、免疫顛覆和免疫缺陷等機制逃避機體的清除,進而引起機體對H.pylori自身天然蛋白成分的免疫耐受,研究表明僅僅選用H.pylori天然抗原進行免疫治療是很難打破機體免疫耐受,激發(fā)有效的免疫應(yīng)答,因此,必須對天然抗原分子進行設(shè)計、修飾和改造。蛋白抗原發(fā)揮其功能主要通過表位來體現(xiàn)特異性,這些表位不僅包括B細胞表位、Th細胞表位、CTL表位等與免疫識別相關(guān)的結(jié)構(gòu),而且還同時存在毒性或抑制性表位等不利于免疫保護的因素。為了提高蛋白抗原的保護性,就必須在表位水平上作出選擇和設(shè)計以得到理想的疫苗分子。借鑒其它疾病表位疫苗的設(shè)計經(jīng)驗,選擇H.pylori優(yōu)勢抗原的保護性、特異性、免疫原性強的表位進行設(shè)計,輔以粘膜佐劑來激發(fā)更強、更特異的、不同于自然感染時的粘膜免疫應(yīng)答,有可能打破免疫耐受,達到預(yù)防或治療H.pylori感染的目的。 H.pylori感染免疫治療后的保護機制較為復(fù)雜,所設(shè)計的不同類型H.pylori治療疫苗的免疫應(yīng)答機制也存在差異。在細胞免疫方面,已有很好的證據(jù)證實:CD4~+T細胞對于H.pylori的免疫保護是必需的,并且,隨著對H.pylori疫苗治療效果及機制研究的深入,逐漸認識到機體抵抗H.pylori感染的保護性機制可能為一種Th1/Th2同時存在的平衡應(yīng)答模式;在體液免疫方面,不能完全排除特異性體液免疫應(yīng)答的作用,基于對H.pylori感染免疫機制的進一步認識和本室先前H.pylori感染治療的動物試驗結(jié)果,H.pylori治療性疫苗的設(shè)計可能遵循以CD4+ T細胞介導(dǎo)的Th1/Th2平衡應(yīng)答為主,兼顧特異性體液免疫的基本策略。 在H.pylori的已知蛋白抗原中,尿素酶B亞單位(UreB)和粘附素(HpaA)是已經(jīng)證實具有很強的抗原性和免疫保護力的抗原。本課題在本室成功篩選和鑒定UreB多個Th細胞表位的基礎(chǔ)上,選用UreB三個優(yōu)勢性Th細胞表位(兩個Th2,一個Th1表位)和文獻報道UreB的一個B細胞表位、HpaA的一個B細胞表位以及分子內(nèi)佐劑LTB,通過計算機輔助設(shè)計和分析對天然抗原表位進行分子設(shè)計、重組、優(yōu)化、計算機分子結(jié)構(gòu)模建等獲得理論上最佳組合方式,按此組合方式構(gòu)建了表達H.pylori五個表位多肽基因(HUepi)與ltB基因的表位疫苗融合蛋白,經(jīng)抗原特性及各表位功能分析后,進行口服免疫治療小鼠H.pylori感染的試驗,觀察H.pylori清除效果及相應(yīng)的免疫應(yīng)答過程,為H.pylori治療性疫苗的設(shè)計與完善奠定基礎(chǔ)。本課題的主要研究方法、結(jié)果與結(jié)論如下: 1.治療性幽門螺桿菌表位疫苗的設(shè)計 選用UreB三個優(yōu)勢性Th細胞表位(兩個Th2,一個Th1表位)和文獻報道UreB的一個B細胞表位、HpaA的一個B細胞表位以及分子內(nèi)佐劑LTB,利用RANKPEP軟件、DNAstar軟件進行表位組合順序分析和串聯(lián)表位與分子內(nèi)佐劑LTB之間連接linker的設(shè)計,獲得理論上最佳組合方式,采用Robetta、Modeller和SPDB viewer軟件進行表位融合蛋白三級結(jié)構(gòu)的模建,獲得理論上最接近天然狀態(tài)下的三級結(jié)構(gòu)。 2.治療性幽門螺桿菌表位疫苗融合蛋白抗原的構(gòu)建、表達、純化 按照第一部分的設(shè)計,在本室成功構(gòu)建表位融合蛋白Uepi的基礎(chǔ)上,分別克隆了表位多肽基因HUepi和ltB基因,采用重疊延伸PCR的方法將兩段基因按照預(yù)先設(shè)計的方向通過linker連接起來,獲得表位多肽與ltB的融合基因(HUepi-ltB),通過限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、XhoⅠ分別構(gòu)建原核表達載體pET22b-HUepi-ltB、pET22b-HUepi和原核表達工程菌株pET22b-HUepi-ltB/BL21、pET22b-HUepi/BL21,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)高效表達分子量分別為20.7 kDa(HUepi-LTB)和8.3 kDa(HUepi)的表位融合蛋白,分別采用不同的純化方案對重組表位融合蛋白HUepi-LTB和HUepi進行純化與鑒定,純化后HUepi-LTB和HUepi的蛋白純度分別為95.2%和97.6%。 3.治療性幽門螺桿菌表位疫苗融合蛋白抗原特性及各表位功能分析 表位疫苗融合蛋白分別免疫家兔制備兔抗HUepi-LTB和HUepi抗血清,采用Western blot和ELISA檢測表位疫苗融合蛋白特異性抗體與rUreB和rHpaA的免疫反應(yīng)性及LTB組分GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)合活性;通過尿素酶抑制實驗、H.pylori與胃上皮細胞(GES-1)的粘附與粘附抑制實驗,血凝與血凝抑制實驗檢測B細胞表位的作用;表位融合蛋白注射免疫小鼠,通過特異性淋巴細胞增殖實驗檢測Th細胞表位作用。結(jié)果表明:表位疫苗融合蛋白產(chǎn)生的特異性抗體能夠與rUreB、rHpaA、rLTB反應(yīng),且融合蛋白中LTB組分保持了與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合活性;抗表位融合蛋白的特異性抗體在一定程度上能夠抑制H.pylori尿素酶的活性,并可阻止H.pylori與胃上皮細胞的粘附和抑制H.pylori與紅細胞的凝集反應(yīng);淋巴細胞增殖實驗證實三個Th表位肽能刺激表位疫苗免疫小鼠的淋巴細胞發(fā)生特異性增殖(SI2),并且表位疫苗致敏的淋巴細胞在rUreB的刺激下可以增殖。實驗證明表位融合蛋白具有良好的免疫原性、免疫反應(yīng)性并且所包含的各表位發(fā)揮了各自的免疫效應(yīng)。 4.治療性幽門螺桿菌表位疫苗免疫治療BALB/c小鼠H.pylori感染效果評價及機制探討 1)表位疫苗治療BALB/c小鼠H.pylori感染效果評價:采用H.pylori動物適應(yīng)菌株SS1感染BALB/c小鼠,成功建立H.pylori感染動物模型,同時建立H.pylori定量培養(yǎng)方法,根據(jù)H.pylori 16S rRNA編碼基因設(shè)計引物建立H.pylori感染的PCR檢測方法。以表位融合蛋白HUepi-LTB和HUepi+rLTB每間隔7～10d,連續(xù)4次對感染H.pylori的BALB/c小鼠進行口服免疫治療,于治療38d后進行H. pylori定量培養(yǎng)檢測、尿素酶實驗、PCR檢測評價表位疫苗的治療效果。結(jié)果顯示表位融合蛋白能夠顯著降低小鼠胃粘膜H.pylori的定植數(shù)量,清除率分別為64.2%和61.5%。 2)表位疫苗治療BALB/c小鼠H.pylori感染保護機制探討: H.pylori感染小鼠予以表位疫苗口服免疫治療38d后,流式細胞術(shù)分析脾淋巴細胞亞群變化,淋巴細胞增殖實驗檢測脾和腸粘膜淋巴細胞的特異性增殖,ELISA檢測脾和粘膜淋巴細胞細胞因子的分泌,RT-PCR檢測脾和腸粘膜淋巴細胞IL-4和IFN-γmRNA表達水平,ELISA檢測特異性抗體IgG、IgA的產(chǎn)生。 結(jié)果顯示:H.pylori超聲上清可顯著刺激表位疫苗免疫治療小鼠脾淋巴細胞和腸粘膜淋巴細胞特異性增殖,與PBS組、佐劑組和單純表位蛋白組差異顯著(P0.01);流式細胞術(shù)分析脾淋巴細胞亞群顯示CD4~+ T淋巴細胞增殖明顯;疫苗作用下脾淋巴細胞和腸粘膜淋巴細胞分泌IFN-γ、IL-4水平較對照組顯著升高(P0.01),RT-PCR結(jié)果顯示脾和腸粘膜淋巴細胞IL-4和IFN-γmRNA表達水平明顯增高;體液免疫應(yīng)答檢測結(jié)果顯示H.pylori表位疫苗可刺激機體產(chǎn)生血清特異性IgG抗體,刺激腸液、唾液及糞便中特異性sIgA水平顯著升高(P0.01)。因此,H.pylori表位疫苗口服免疫后可誘導(dǎo)產(chǎn)生局部粘膜和全身性體液免疫應(yīng)答和Th1/Th2混合型細胞免疫應(yīng)答,起到清除H.pylori感染的作用。
[Abstract]:Helicobacter pylori ( H . pylori ) is the main pathogenic bacterium of chronic gastritis and gastroduodenal ulcer . It is closely related to gastric cancer and gastric mucosa associated lymphoid tissue lymphoma . It has been classified as type I oncogenic factor by the World Health Organization .






In recent years , it is very difficult to design , modify and modify the epitope of H . pylori . The epitope vaccine has become a new direction for the development of vaccine designs such as infectious diseases , malignant tumors and autoimmune diseases .






The protective mechanism of H . pylori ( H . pylori ) infection is complicated . There is also a difference in the immune response mechanism of different types of H . pylori . In the aspect of cellular immunity , it has been proved that the protective mechanism of CD4 ~ + T cells is necessary for the immune protection of H.pylori .






In the known protein antigens of H.pylori , the urease B subunit ( UreB ) and adhesin ( HpaA ) have been proved to have strong antigenicity and immune protection .






1 . Design of therapeutic Helicobacter pylori epitope vaccine






Three dominant Th cell epitopes of UreB ( two Th2 , one Th1 epitope ) and one B cell epitopes of UreB , one B cell epitope of HpaA and internal adjuvant LTB were reported . Using RANKPEP software , DNAstar software was used to analyze the epitope combined sequence analysis and the linkage linker between tandem epitope and internal adjuvant LTB . The best combination was obtained . The three - stage structure of epitope fusion protein was obtained by using Robetta , Modeller and SPDB viewer software .






2 . Construction , expression and purification of therapeutic Helicobacter pylori epitope vaccine fusion protein antigen






The huepi - LTB and HUepi - Huepi - ltB / BL21 , pET22b - HUepi - ltB / BL21 , pET22b - HUepi - ltB / BL21 , pET22b - HUepi - ltB / BL21 , pET22b - HUepi - ltB / BL21 , pET22b - HUepi - ltB / BL21 , pET22b - HUepi - LTB and HUepi were respectively constructed . The purity of HUepi - LTB and HUepi were 95.2 % and 97.6 % respectively .






3 . Analysis of the antigenic properties of the epitope vaccine fusion protein and the functional analysis of each epitope






The anti - HUepi - LTB and HUepi antiserum were prepared in rabbits immunized with epitope vaccine . Western blot and ELISA were used to detect the binding activity of the specific antibody of epitope vaccine fusion protein with rUreB and rHpaA .






Evaluation and mechanism of Helicobacter pylori epitope vaccine in BALB / c mice infected with H . pylori infection






1 ) The effect of epitope vaccine on H . pylori infection in BALB / c mice was evaluated : H.pylori infected BALB / c mice were infected with H . pylori ( H . pylori ) , and H . pylori quantitative culture was established . The results showed that the epitope fusion protein could significantly reduce the number of H.pylori colonization in mice . The results showed that the epitope fusion protein could significantly reduce the number of H.pylori colonization in mice . The clearance rate was 64.2 % and 61.5 % , respectively .






2 ) The protective mechanism of epitope vaccine in the treatment of H . pylori infection in BALB / c mice :






After oral immunization with the epitope vaccine of H . pylori infected mice , the lymphocyte subsets were analyzed by flow cytometry , the specific proliferation of lymphocytes of spleen and intestinal mucosa was detected by lymphocyte proliferation assay , the secretion of cytokines in spleen and mucosal lymphocytes was detected by ELISA , the levels of IL - 4 and IFN - 緯 mRNA were detected by RT - PCR , and the production of IgG and IgA was detected by ELISA .






The results showed that H . pylori could significantly stimulate the specific proliferation of lymphocytes and lymphocytes in spleen lymphocytes and intestinal mucosa of mice immunized with epitope vaccine . The results showed that the levels of IL - 4 and IFN - 緯 mRNA in lymphocytes of spleen and intestinal mucosa were significantly higher than those in control group ( P0.01 ) . The results of humoral immune response showed that the levels of IL - 4 and IFN - 緯 mRNA in lymphocytes and intestinal mucosa increased significantly ( P0.01 ) .

【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

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