發(fā)布時間：2018-03-29 14:41

  本文選題：基因免疫　切入點(diǎn)：重組質(zhì)粒　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 目的：本研究采用人類促甲狀腺激素受體(human thyrotropin receptor，hTSHR)膜外區(qū)(extracellular domain，ECD)氨基端的兩個片段hTSHRf(188～403bp)、hTSHRe(407～904bp)，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1／hTSHRf和pcDNA3.1／hTSHRe，將其轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary cells，CHO)細(xì)胞，在CHO細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)；然后用重組質(zhì)粒免疫BALB／c小鼠，建立Graves病的動物模型。 方法：提取人甲狀腺正常組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用RT-PCR法擴(kuò)增hTSHR膜外區(qū)兩個片段hTSHRf和hTSHRe，回收純化后，定向插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(D)／V5-His-TOPO中，然后轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)菌株TOP10 E.coli，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1／hTSHRf、pcDNA3.1／hTSHRe，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ酶切、PCR擴(kuò)增及測序方法進(jìn)行核酸序列鑒定。通過Lipofectamine2000脂質(zhì)體介導(dǎo)法，將重組質(zhì)粒分別導(dǎo)入CHO細(xì)胞，G418篩選陽性克隆細(xì)胞株后，RT-PCR法分別擴(kuò)增兩個片段的陽性克隆細(xì)胞株，進(jìn)行目的基因的轉(zhuǎn)錄鑒定，裂解轉(zhuǎn)染后的CHO細(xì)胞，用Western Blotting鑒定hTSHR在蛋白水平的表達(dá)。大量提取重組質(zhì)粒，并去內(nèi)毒素后，于第1，，4，7，9，10周股四頭肌注射免疫BALB／c小鼠，對照組注射生理鹽水，分別于第0，6，11周內(nèi)眥取血，分離血清，于第11周處死小鼠，取小鼠一側(cè)甲狀腺常規(guī)病理切片，HE染色，觀察各組甲狀腺形態(tài)學(xué)變化；酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法測定小鼠血清中TRAb的含量；放射免疫測定法(radio immunity assay，RIA)測定血清中TSAb和TBAb的含量；RIA法測定血清中T4的含量。 結(jié)果：1．PCR擴(kuò)增所得的兩個片段分別為216bp、534bp，與預(yù)期的大小相符，所構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和PCR鑒定同預(yù)期的大小一致，測序結(jié)果與Gene Bank中收錄的hTSHR的相應(yīng)片段序列相同，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功；2．以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，篩選陽性克隆細(xì)胞株后，RT-PCR分別擴(kuò)增兩個片段的陽性克隆株，所得片段大小分別為216bp、534bp，與預(yù)期的大小一致，經(jīng)Western Blotting鑒定重組蛋白有免疫原性，蛋白的分子量分別為11.94KD、23.6KD左右，與預(yù)期的大小相符；3．ELISA測定血清中TRAb，結(jié)果顯示：pcDNA3.1／hTSHRf免疫組第6周高于第0周(P＜0.05)，第11周持續(xù)增高(P＜0.01)；pcDNA3.1／hTSHRe免疫組第11周明顯高于第6周以及第0周(P＜0.05)：對照組血清TRAb含量差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；4．RIA法測定血清中TSAb和TBAb指數(shù)，TSAb指數(shù)：pcDNA3.1／hTSHRf免疫組第6周比第0周明顯升高(P＜0.01)，第11周持續(xù)升高(P＜0.05)，pcDNA3.1／hTSHRe免疫組第6周、第11周明顯高于第0周(P＜0.05)，對照組TSAb指數(shù)差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；TBAb指數(shù)：pcDNA3.1／hTSHRf免疫組、pcDNA3.1／hTSHRe免疫組以及對照組均沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；5．RIA法測定血清中T4含量，pcDNA3.1／hTSHRf免疫組第11周、第6周明顯高于第0周(P＜0.05)，pcDNA3.1／hTSHRe免疫組第6周高于第0周(P＜0.01)，第11周持續(xù)增高(P＜0.05)，而對照組血清T4含量差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；6．組織病理學(xué)檢查，pcDNA3.1／hTSHRf和pcDNA3.1／hTSHRe免疫組的甲狀腺組織，可見大量新生濾泡生成，濾泡上皮增生，偶可見炎性細(xì)胞浸潤；對照組甲狀腺組織形態(tài)則基本正常。 結(jié)論：1．成功構(gòu)建了hTSHR真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1／hTSHRf及pcDNA3.1／hTSHRe；2．脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，篩選得到陽性克隆細(xì)胞株，RT-PCR證明了重組質(zhì)粒與CHO細(xì)胞的基因組整合，并轉(zhuǎn)錄成功，Western blotting證實(shí)了重組蛋白在體外成功的表達(dá)；3．通過對TRAb、TSAb和TBAb指數(shù)、T4等指標(biāo)的測定以及組織病理學(xué)檢查，證實(shí)基因免疫BALB／c小鼠成功建立了Graves病的動物模型。
[Abstract]:Objective : To study the expression of hTSHRf ( 188 锝

本文編號：1681585