本文選題：SARS病毒　切入點(diǎn)：噬菌體表面展示　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2005年博士論文

【摘要】：SARS冠狀病毒引起的嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)綜合癥,具有很高的傳染性和致死率,目前尚無(wú)特異性預(yù)防及治療藥物,研究抗SARS病毒人源抗體被動(dòng)免疫,將有助于對(duì)SARS病人的救治。 目前噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)已成為人源抗體制備的強(qiáng)有力工具,它易于操作,篩選容量大,有利于獲得一些稀有抗體,并可直接獲得完全人源的單克隆抗體。本研究工作可分為4個(gè)部分:抗體庫(kù)的構(gòu)建、抗體庫(kù)的富集及特異性單克隆抗體的篩選、中和抗體MlA的可溶性表達(dá)及純化、MlA抗體活性的定量分析。 一、噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建 建立人抗SARS病毒Fab抗體基因庫(kù)的淋巴細(xì)胞來(lái)源于恢復(fù)期SARS患者的外周血,免疫熒光及體外中和試驗(yàn)檢測(cè)抗SARS病毒抗體的滴度≥1:256及1:64,這為建立可能篩選出高親和力的抗體基因庫(kù)創(chuàng)造了條件。提取淋巴細(xì)胞RNA,利用RT-PCR方法克隆出7條重鏈Fd段抗體基因和9條輕鏈抗體基因,依次將輕鏈基因混合物和重鏈基因混合物酶切后連入載體pComb3內(nèi),構(gòu)建成人源Fab分子噬菌體表面呈現(xiàn)文庫(kù),庫(kù)容約2×10~6。 二、抗體庫(kù)的富集及特異性單克隆抗體的篩選 目前大量研究結(jié)果表明,SARS病毒的4個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白中,S蛋白的主要功能是通過(guò)特異受體介導(dǎo)病毒與靶細(xì)胞結(jié)合,引起細(xì)胞融合,它是宿主免疫應(yīng)答的重要靶位。從抗體庫(kù)中篩選抗SARS病毒中和抗體,以S蛋白作為篩選靶標(biāo),對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行了富集篩選,經(jīng)過(guò)4輪的“吸附結(jié)合-洗脫-擴(kuò)增”過(guò)程,富集了抗S蛋白噬菌體抗體庫(kù)。 人源單克隆抗體的篩選分為兩個(gè)過(guò)程,結(jié)合特異性和中和活性的篩選。首先確立了可靠的雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)抗S蛋白特異性抗體。從50株隨機(jī)挑取的Fab抗體克隆中篩選出12株抗S蛋白特異性抗體,然后測(cè)定其對(duì)SARS病毒的中和活性,篩選到一株抗體,有明顯的抗SARS病毒中和活性,可推遲細(xì)胞病變的發(fā)生,編號(hào)為MlA;基因測(cè)序分析表明MlA抗體的輕鏈為V_k 3a家族基因,重鏈為V_H3家族基因。
[Abstract]:Severe respiratory syndrome (SARS) caused by SARS coronavirus is highly infectious and fatal. So far there are no specific drugs for prevention and treatment. The study of passive immunization against human antibodies against SARS virus will be helpful to the treatment of SARS patients. At present, phage antibody library technology has become a powerful tool for the preparation of human antibody, it is easy to operate, screening capacity is large, and it is helpful to obtain some rare antibodies. The work can be divided into four parts: the construction of antibody library, the enrichment of antibody library and the screening of specific monoclonal antibody. Soluble expression of neutralizing antibody MlA and quantitative analysis of purified MlA antibody activity. Construction of phage antibody library. Lymphocytes derived from the peripheral blood of convalescent SARS patients established the human anti-virus Fab antibody gene bank. Immunofluorescence and neutralization test in vitro were used to detect the titers of antibodies against SARS virus 鈮，

本文編號(hào)：1671443