本文選題：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子　切入點(diǎn)：制備　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2006年博士論文

【摘要】：pUDK-HGF是由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的攜帶人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)基因真核表達(dá)的質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)表明pUDK-HGF可促進(jìn)肢體缺血部位的血管生成，從而改善肢體功能。pUDK-HGF具有開(kāi)發(fā)成為新的基因藥物的前途。pUDK-HGF已獲中國(guó)專利�！爸亟M質(zhì)粒-肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子注射液”正在注冊(cè)申請(qǐng)進(jìn)行肢體動(dòng)脈閉塞癥的基因治療臨床試驗(yàn)。 一、質(zhì)粒pUDK-HGF的大規(guī)模制備和質(zhì)量分析 質(zhì)粒pUDK-HGF的大規(guī)模制備是其藥學(xué)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，我們建立了pUDK-HGF中試生產(chǎn)流程，主要包括發(fā)酵、細(xì)菌堿液裂解、Q-Sepharose XL色譜柱富集質(zhì)粒、Sephacry S1000凝膠色譜分離、Source15Q色譜精制分離、質(zhì)粒沉淀、重溶、無(wú)菌過(guò)濾及分裝等步驟。并對(duì)發(fā)酵條件如培養(yǎng)基、pH值、轉(zhuǎn)速、細(xì)菌堿性裂解及色譜分離條件進(jìn)行了優(yōu)化。所建立的生產(chǎn)流程重復(fù)性良好，質(zhì)粒DNA的回收率較高(約45％)。經(jīng)質(zhì)量檢定其產(chǎn)品均符合擬定的各項(xiàng)質(zhì)量檢定指標(biāo)。所有步驟采用一般生物制品制備方法，沒(méi)有特殊的技術(shù)要求和使用特殊的試劑等，存在進(jìn)一步放大規(guī)模的可能性。 根據(jù)相關(guān)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道及我國(guó)基因治療質(zhì)量控制指導(dǎo)原則，制定pUDK-HGF質(zhì)粒制造檢定規(guī)程，并按此逐項(xiàng)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室中試生產(chǎn)制備的05批次pUDK-HGF的質(zhì)量進(jìn)行了分析研究。05批次pUDK-HGF的主要質(zhì)量如下：pUDK-HGF濃度為2.01mg／ml：A260／A280=1.86；超螺旋pUDK-HGF比例為95.09％；電泳圖中未見(jiàn)RNA；殘留宿主DNA含量＜0.2％質(zhì)粒DNA；菌體蛋白質(zhì)殘留含量＜0.1％質(zhì)粒DNA；限制性酶切圖譜與自行制備的對(duì)照品一致；PCR擴(kuò)增到HGF基因片段，大小約2.2kb；未見(jiàn)殘余抗生素(卡那霉素)抑菌圈；細(xì)菌內(nèi)毒素＜10EU／mg；pUDK-HGF轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞上清中HGF表達(dá)量為39.15(ng／ml)，表達(dá)的上清誘導(dǎo)ECV304細(xì)胞遷移數(shù)高于空質(zhì)粒對(duì)照組2倍。05批次的產(chǎn)品經(jīng)檢驗(yàn)符合擬定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。該批產(chǎn)品已經(jīng)中國(guó)生物制品檢定所復(fù)核檢定合格。
[Abstract]:PUDK-HGF is a eukaryotic expression plasmid carrying human hepatocyte growth factor-hGFgene constructed in our laboratory. The results show that pUDK-HGF can promote angiogenesis in ischemic region of limbs. Thus, improving limb function. PUDK-HGF has the prospect of being developed as a new gene drug. PUDK-HGF has been patented in China. "Recombinant plasmide-hepatocyte growth factor injection" is applying for clinical trials of gene therapy for extremity arterial occlusive disease. 1. Large-scale preparation and quality analysis of plasmid pUDK-HGF. The preparation of plasmid pUDK-HGF on a large scale is the key link of its pharmacological research. We have established a pilot production process of pUDK-HGF, which mainly includes fermentation, enrichment of plasmid Sephacry S1000 gel chromatographic separation and plasmid precipitation on Q-Sepharose XL chromatographic column. The fermentation conditions such as pH value of culture medium, rotational speed, bacterial alkaline cracking and chromatographic separation conditions were optimized. The recovery rate of plasmid DNA was high (about 45%). The products of plasmid DNA were in accordance with the quality control indexes. All the steps were prepared by general biological products, without special technical requirements and with special reagents, etc. There is the possibility of further scaling up. According to the relevant foreign literature reports and the guiding principles of gene therapy quality control in China, the pUDK-HGF plasmid manufacturing verification regulation was established. According to this, the quality of 05 batches of pUDK-HGF produced in pilot production in our laboratory was analyzed and studied. The main mass of 05 batches of pUDK-HGF was as follows: the concentration of pUDK-HGF was 2.01mg / ml / A260 / A280N 1.86; the ratio of superhelical pUDK-HGF was 95.09; no RNAs were found in electrophoretic map; the content of residual host DNA was < 0.2%. Plasmid DNA; residual protein content of bacteria < 0.1% plasmid DNA; restriction endonuclease digesting map was consistent with the self-prepared reference material to amplify the HGF gene fragment. The size of kanamycin was about 2.2 kb, and no residual antibiotic (kanamycin) inhibition circle was found. The expression of HGF in the supernatant of CHO cells transfected with bacterial endotoxin < 10 EUP / mggpUDK-HGF was 39.15 ng / ml ~ (-1), and the number of ECV304 cell migration induced by the supernatant was 2 times higher than that of the blank plasmid control group. The National Institute for the Control of Biological products is eligible for verification and verification.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R346

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5 張R

本文編號(hào)：1655451