本文選題：O157:H7大腸桿菌　切入點：減毒鼠傷寒沙門氏菌　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 研究背景及目的 O157:H7是腸出血性大腸桿菌的一個主要血清型(本文簡稱為O157),感染該菌可使人患腹瀉、出血性結(jié)腸炎、也可引發(fā)溶血性尿毒綜合征及血小板減少性紫癜等并發(fā)癥,嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。自1982年被確定為致病菌的20多年間,世界各地已發(fā)生了多起O157的暴發(fā)流行,表明O157的感染已成為一個全球性的公共衛(wèi)生問題。然而目前缺乏有效的防治方法,研究證實抗生素可促使O157菌釋放致死性志賀毒素(Stx),從而使患者并發(fā)溶血性尿毒綜合癥的危險性增加,因此,研制O157疫苗對預(yù)防和控制O157感染有著極其重大的意義。 EspA(大腸桿菌分泌蛋白A)、IntiminC300(緊密粘附素Intimin C端片段約1/3部分)和Stx2B(志賀毒素2 B亞單位)都是O157重要的保護性抗原。EspA作為O157Ⅲ型分泌系統(tǒng)的重要元件,在O157感染引起的宿主細(xì)胞A/E(attaching/effacing)損傷過程中起重要的橋梁作用。人和動物感染O157后,機體可產(chǎn)生高水平的EspA抗體。緊密粘附素(Intimin)介導(dǎo)細(xì)菌與腸上皮細(xì)胞的緊密粘附,是O157最主要的定植因子,尤其是它的C端約1/3部分(Intimin-C)為胞外功能區(qū),可與相應(yīng)受體結(jié)合,具有良好的免疫原性和免疫保護性。Stx2是O157致溶血性尿毒綜合征的一個主要毒素,其中B亞單位(Stx2B)具有細(xì)胞結(jié)合的特性,表現(xiàn)出良好的免疫原性,而針對Stx2B的單克隆抗體具阻斷毒素的作用。 減毒沙門氏菌因為能夠通過粘附、侵襲、定居在腸道相關(guān)淋巴組織,已被證實為有效的粘膜免疫載體工具,可經(jīng)腸系膜淋巴結(jié)到達肝臟、脾臟,進一步有效地刺激機體產(chǎn)生粘膜、細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。特別是近來利用不以抗生素作為選擇壓力的載體-宿主平衡致死系統(tǒng)構(gòu)建的減毒沙門氏菌載體疫苗已顯示出良好的應(yīng)用前景。 因此本實驗利用pYA3149的載體-宿主平衡致死系統(tǒng)表達O157的EspA及其IntiminC300、Stx2B的融合保護性抗原,構(gòu)建以減毒鼠傷寒沙門氏菌為載體的腸出血性大腸桿菌O157:H7疫苗,并通過動物實驗觀察重組載體疫苗的免疫原性及免疫保護性,為發(fā)展新型的O157疫苗提供實驗依據(jù)。 實驗結(jié)果: 1.采用PCR技術(shù)擴增獲得了579bp的EspA基因、1476bp的EspA-IntiminC300和1767bp的EspA-IntiminC300-Stx2B融合基因,經(jīng)測序鑒定正確后分別連接到平衡-致死載體pYA3149上,再依次轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的asd基因缺失突變株x6097、沙門氏菌中間宿主x3730及終宿主菌x4550。IPTG誘導(dǎo)重組工程菌x4550 (pYA3149- EspA)、X4550(pYA3149-EspA-IntiminC300)及X4550(pYA3149- EspA- Intimin C 300-Stx2B),成功表達了上述三種抗原蛋白,免疫印跡證實所表達蛋白能與相應(yīng)抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。 2.對重組減毒傷寒沙門氏菌載體疫苗株進行體外穩(wěn)定性實驗, x4550 (pYA3149-EspA)、X4550(pYA3149-EspA-IntiminC300)及X4550(pYA3149- EspA- Intimin C300-Stx2B)在有選擇壓力(不含DAP)和無選擇壓力(含DAP)的條件下傳10代后隨機挑取100個菌落分別接種于不含DAP的LB平板及含DAP的LB平板上培養(yǎng),結(jié)果無論有無選擇壓力存在,所挑取的菌落99%均生長,從中隨機選出20個菌落抽提質(zhì)粒,95%的菌落含有重組質(zhì)粒。表明構(gòu)建的重組工程菌在體外有較好的遺傳穩(wěn)定性。 3.以重組減毒傷寒沙門氏菌載體疫苗口服免疫三次Balb/c小鼠后,各實驗組免疫后血清特異性抗體GMT值與免疫前相比均差異顯著(p0.001),與對照組相比也差異顯著(p0.001)。三次口服后再注射重組蛋白加強免疫一次,血清特異性抗體大幅增高(p0.001)。 4.利用肥達氏反應(yīng)、SS選擇培養(yǎng)、PCR、免疫熒光等方法檢測,進一步證實重組減毒傷寒沙門氏菌載體疫苗3次口服免疫后能在小鼠脾、Peyer,s結(jié)和回腸定植,且能特異表達O157的相關(guān)抗原。 5.免疫后小鼠以1×109CFU/只劑量的O157全菌液進行攻毒免疫保護實驗,結(jié)果表明3次口服重組載體疫苗后x4550(pYA3149-EspA)、x4550(pYA3149-EspA Intimin C300)及x4550(pYA3149-EspA-IntiminC300-Stx2B)組保護率分別為36%、44%和62%,注射重組蛋白加強免疫后保護率分別提高到56%、67%和89%。不經(jīng)口服只注射蛋白抗原的小鼠,免疫后保護率為0%、11%、11%。 結(jié)論: 1.采用平衡-致死系統(tǒng)分別構(gòu)建了表達O157:H7 EspA、EspA-IntiminC300及EspA-IntiminC300-Stx2B的重組減毒沙門氏菌載體疫苗株,并且構(gòu)建的疫苗株無論有無選擇壓力均能穩(wěn)定地在體外傳代培養(yǎng)。 2.構(gòu)建的針對O157的重組減毒傷寒沙門氏菌載體疫苗表現(xiàn)出良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。三次口服免疫Balb/c小鼠,重組菌能穩(wěn)定地定植在小鼠的脾、PP結(jié)、回腸等部位,表達O157特異性抗原,刺激機體產(chǎn)生針對O157的特異性抗體,尤其是口服后注射抗原加強免疫組特異性抗體增高顯著,能較好地保護小鼠抵抗O157的感染。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1639547