本文選題：基因克隆　切入點：基因工程菌　出處：《中南大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的： 將尿酸氧化酶基因克隆到乳酸桿菌中，使之能產(chǎn)生尿酸氧化酶，為一菌多基因克隆打下基礎(chǔ)。 方法： 從產(chǎn)朊假絲酵母菌中提取基因組DNA，根據(jù)genbank上已知的該菌尿酸氧化酶基因序列，設(shè)計引物PCR擴增尿酸氧化酶基因片段，將其克隆入質(zhì)粒pMG36e，構(gòu)建成重組質(zhì)粒PMG36e-U，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選鑒定，提取重組質(zhì)粒PMG36e-U，把重組質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化保加利亞乳酸桿菌，SDS-PAGE鑒定基因工程菌體裂解液中的尿酸氧化酶，并測定尿酸氧化酶的活性。 結(jié)果： 1．從產(chǎn)朊假絲酵母基因組中擴增到的尿酸氧化酶基因片段長度為0.9kb。 2．構(gòu)建的含重組質(zhì)粒pMD18-T-U的大腸桿菌，用XhaⅠ和HindⅢ雙酶切及菌落PCR鑒定，并測序鑒定，基因片段序列與genebank上尿酸氧化酶基因序列完全一致。 3．用含2.5μg／mL的紅霉素MRS培養(yǎng)基篩選到用重組質(zhì)粒pMG36e-U成功轉(zhuǎn)化的重組保加利亞乳酸桿菌。 4．重組保加利亞乳酸桿菌經(jīng)不連續(xù)SDS-PAGE分析，表達(dá)重組蛋白的分子量約為34KD，，與從尿酸氧化酶基因序列推測的303個氨基酸的理論分子量相符。 5．在體外測定用DEAE DE52纖維柱純化后的重組保加利亞乳酸桿菌酶液，酶活性可達(dá)0.39u／mL，較原始菌株稍低。 結(jié)論： 尿酸氧化酶基因克隆入保加利亞乳酸桿菌中，并具有酶分解能力。 目的： 將肌酐水解酶基因克隆到保加利亞乳酸桿菌中，使之能產(chǎn)生肌酐水解酶，為一菌多基因克隆打下基礎(chǔ)。 方法： 從惡臭假單胞菌中提取基因組DNA，根據(jù)genbank上已知的惡臭假單胞菌肌酐水解酶基因序列，設(shè)計引物PCR擴增肌酐水解酶基因片段，將其克隆入質(zhì)粒pMG36e，構(gòu)建成重組質(zhì)粒PMG36e-C，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選鑒定，提取重組質(zhì)粒PMG36e-C，把重組質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化保加利亞乳酸桿菌，SDS-PAGE鑒定基因工程菌體裂解液中的肌酐水解酶，并測定肌酐水解酶的活性。 結(jié)果： 1．從惡臭假單胞菌基因組中擴增到的肌酐水解酶基因片段在小為0.78kb。 2．構(gòu)建的含重組質(zhì)粒pMD18-T-C的大腸桿菌，用XhaⅠ和HindⅢ雙酶切及菌落PCR鑒定，并測序鑒定，基因片段序列與genebank上肌酐水解酶基因序列完全一致。 3．用含2.5μg／mL的紅霉素MRS培養(yǎng)基篩選到重組質(zhì)粒pMG36e-C成功轉(zhuǎn)化的重組保加利亞乳酸桿菌。 4．重組保加利亞乳酸桿菌經(jīng)不連續(xù)SDS-PAGE分析，表達(dá)重組蛋白的分子量約為28KD，與從肌酐水解酶基因序列推測的260個氨基酸的理論分子量相符。 5．在體外測定用DEAE DE52纖維柱純化后的重組保加利亞乳酸桿菌酶液，酶活性可達(dá)0.19 u／mL，較原始菌株稍低。 結(jié)論： 肌酐水解酶基因克隆入保加利亞乳酸桿菌中，并具有酶分解能力。
[Abstract]:Objective:. The uric acid oxidase gene was cloned into Lactobacillus to produce uric acid oxidase. Methods:. Genomic DNA was extracted from Candida prion. According to the known gene sequence of uric acid oxidase in genbank, a primer PCR was designed to amplify the gene fragment of uric acid oxidase. The recombinant plasmid was cloned into pMG36e. the recombinant plasmid PMG36e-U was constructed and transformed into E. coli DH5 偽. The recombinant plasmid PMG36e-U was extracted by electroporation. The recombinant plasmid was electroporated into Lactobacillus bulgaricus SDS-PAGE to identify the uric acid oxidase in the lytic fluid of genetically engineered bacteria. The activity of uric acid oxidase was determined. Results:. 1. The length of uric acid oxidase gene amplified from the genome of Candida prion was 0.9kb. 2. Escherichia coli containing recombinant plasmid pMD18-T-U was digested by Xha 鈪

本文編號：1632754