本文選題：人胚胎干細胞　切入點：成骨細胞　出處：《大連醫(yī)科大學》2005年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的: 探討人體細胞核移植來源的兔-人胚胎干細胞(SCNT-rhESCs)體外保持未分化狀態(tài)的擴增能力及其人胚胎干細胞特性,著重探討 SCNT-rhESCs 在體外向成骨表型細胞分化的潛能和條件,嘗試為骨組織工程探尋一種含有人自體基因、無免疫排斥反應、具有高分化潛能的全新種子細胞。 方法: 應用已建立的人體細胞核移植來源的兔-人胚胎干細胞(SCNT-rhESCs)系體外擴增培養(yǎng) 50 代后,進行系統(tǒng)的干細胞特性鑒定并進行體外成骨定向誘導分化研究。采用機械法收集 SCNT-rhESCs,首先在體外懸浮培養(yǎng)形成含有三個胚層(內、中、外胚層)定向祖細胞的擬胚體(Embryoid body,EB)。7 天后,將擬胚體轉入細胞培養(yǎng)板內進行貼壁培養(yǎng),分組進行成骨定向誘導研究:一組為成骨誘導組,采用含抗壞血酸(50mg/L)、地塞米松 (1×10-8 mol/L)、β-甘油磷酸(10mmol/L)、15%胎牛血清的α-MEM 礦化培養(yǎng)基;另一組為非誘導組,采用僅含 15%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基;采用具有成骨能力的胎兒骨髓間充質干細胞(MSC)作為實驗的陽性對照。各組細胞均置于 37℃,5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。采用倒置顯微鏡適時觀測誘導過程中的細胞形態(tài)學變化;通過茜素紅染色、堿性磷酸酶(Gomori-鈣鈷法)染色、S-P 法免疫組化及免疫熒光染色檢測骨鈣素(Osteocalcin, OCN)以及Ⅰ型膠原的表達以鑒定成骨誘導后的細胞表型。 結果: SCNT-rhESCs 在體外擴增培養(yǎng) 50 代后,仍能保持未分化狀態(tài)并具有人胚胎 干細胞特性。表現(xiàn)為:人胚胎干細胞特異性表面標志 SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60等陽性,而鼠胚胎干細胞表面標志 SSEA-1 陰性,細胞核型正常,DNA 微衛(wèi)星遺傳標志分析顯示其基因型與供體細胞完全一致,并且 SCNT-rhESCs 可以在體外自發(fā)分化形成擬胚體。同時,擬胚體貼壁培養(yǎng)后在成骨誘導劑的作用下 2-3 周時有成骨表型細胞出現(xiàn),表現(xiàn)為:倒置鏡下細胞呈多偽足或鱗片樣,能形成茜素紅染色陽性的骨結節(jié);成熟成骨細胞標志——堿性磷酸酶染色陽性;S-P 法免疫組化及免疫熒光染色示骨組織中的主要膠原蛋白成分——Ⅰ型膠原以及骨組織中的主要的非膠原蛋白成分、成骨晚期標志物——骨鈣素均呈陽性,提示 SCNT-rhESCs 在體外經成骨誘導劑的定向誘導后可以產生穩(wěn)定的成骨表型細胞。而非誘導組SCNT-rhESCs 則形態(tài)各異,在不同時間段內部分自發(fā)分化成為神經元樣細胞、脂肪樣細胞、肌肉樣細胞以及其他未定型細胞,未觀察到有明顯的成骨表型細胞出現(xiàn)。 結論: 1.人體細胞核移植來源的兔-人胚胎干細胞——SCNT-rhESCs 可在體外進行擴增且能保持干細胞的未分化特性和多向分化潛能。 2.同時,在成骨誘導劑的作用下 SCNT-rhESCs 可以分化成為穩(wěn)定的成骨表型細胞。 因此,由 SCNT-rhESCs 來源的成骨細胞可以作為胚胎早期骨發(fā)生、發(fā)育的研究模型并可為骨組織工程提供全新的包含人自體基因、無免疫排斥反應的新種子細胞。
[Abstract]:Objective:
To explore the source of human nuclear transplantation in rabbit human embryonic stem cells (SCNT-rhESCs) and its ability to maintain amplification of embryonic stem cell characteristics in an undifferentiated state in vitro, to study SCNT-rhESCs cells to differentiate into osteoblasts phenotype potential and conditions in vitro, find a gene containing human autologous bone tissue engineering, without immune rejection. With high differentiation potential of new seed cells.
Method:
The application of the established human somatic cell nuclear transfer from rabbit human embryonic stem cell line (SCNT-rhESCs) cultured in vitro after 50 generations, the system of stem cell characterization and in vitro differentiation of bone orientation. Collect SCNT-rhESCs by mechanical method, first suspended in vitro formation containing three germ layers (in., ectoderm) embryoid body oriented progenitor cells (Embryoid body, EB).7 days, the embryoid bodies into cell culture plates in adherent culture, grouping osteogenic induction study: a group of osteogenic induction group, with ascorbic acid (50mg/L), dexamethasone (1 x 10-8 mol/L), beta glycerophosphate (10mmol/L), alpha -MEM mineralization in 15% fetal bovine serum medium; another group of non induced group, using only a -MEM containing 15% fetal bovine serum medium; with osteogenic ability of fetal bone marrow mesenchymal stem cells (MSC) as the experiment The positive control groups. Cells were placed in the temperature of 37 DEG 5%CO2 saturated humidity incubator, timely observation training. The morphological changes of the cells during induction by inverted microscope; by alizarin red staining, alkaline phosphatase (Gomori- calcium cobalt method) staining, S-P immunohistochemistry and immunofluorescence staining of osteocalcin (Osteocalcin, OCN) and the expression of collagen I in the identification of a cell phenotype induced by bone.
Result:
After 50 generations of culture in vitro, SCNT-rhESCs can still remain undifferentiated and have human embryo.
The characteristics of stem cells. For human embryonic stem cell specific surface markers SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 positive, and embryonic stem cell surface marker SSEA-1 negative cells, normal karyotype, DNA microsatellite genetic marker analysis showed that the genotype is consistent with the donor cells, and SCNT-rhESCs can differentiate spontaneously in vitro embryoid body. At the same time, the embryoid wall after cultured in considerate osteogenic agent under the effect of 2-3 weeks of osteogenic phenotype cells, showed: cells under inverted microscope showed many pseudopodia or scales, can form bone nodules alizarin red staining positive; mature osteoblasts -- alkaline phosphatase staining; S-P method of immunohistochemistry and immunofluorescence staining of collagen components are shown in the bone tissue of type I collagen and bone tissue in the main non collagen, bone markers osteocalcin were advanced Positive tip induced directional SCNT-rhESCs in vitro osteogenic inducer can produce bone phenotype cells into stable and non induced group SCNT-rhESCs is different in different period, part of spontaneous differentiation into neuron like cells, fat cells, muscle cells and other undifferentiated cells, was observed there appear obvious osteogenic phenotype of cells.
Conclusion:
1., rabbit human embryonic stem cells derived from human cell nuclear transfer, SCNT-rhESCs can be amplified in vitro and can maintain the undifferentiated and pluripotent differentiation potential of stem cells.
2. at the same time, the osteogenic agent under the action of SCNT-rhESCs can differentiate into bone cells into a stable phenotype. Therefore, SCNT-rhESCs derived osteoblasts can be used as early embryonic bone development and research, the model can provide a new gene containing autologous bone tissue engineering, without immune rejection of new seed cells.

【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：R329

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