本文選題：組織工程　切入點：脂肪成體干細胞　出處：《第四軍醫(yī)大學》2007年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 關節(jié)軟骨的損傷和缺損是骨科常見的問題之一。關節(jié)軟骨再生及自我修復能力極為有限,而傳統(tǒng)的治療方法如磨削術、鉆孔微骨折術等均存在一定的缺陷,遠期療效不甚理想。近年來組織工程技術的發(fā)展為解決這一難題帶來了新的希望,有望成為治療軟骨損傷的新方法。軟骨組織工程就是將種子細胞接種到合適的生物支架材料上,在體外誘導后或者直接植入體內修復軟骨缺損。因此,種子細胞及生物支架材料在組織工程軟骨的構建中有著舉足輕重的地位。 目的:從兔脂肪組織中分離出脂肪成體干細胞(ADASCs),體外經(jīng)原代及傳代培養(yǎng)后,在轉化生長因子-β1(TGF-β1)存在的條件下,對比觀察不同濃度的血清對ADASCs向軟骨細胞增殖和分化的影響,探索較為合適的血清濃度;再將穩(wěn)定傳代后的ADASCs種植于纖維蛋白膠/透明質酸(FG/HA)復合支架上,在含TGF-β1的軟骨誘導液中誘導培養(yǎng),體外構建ADASCs、纖維蛋白膠/透明質酸及轉化生長因子的組織工程軟骨模塊,探討FG/HA作為軟骨組織工程支架材料的可行性。 方法:1、ADASCs在不同的血清濃度下向軟骨細胞分化:取成年新西蘭兔頸部脂肪組織,剪碎后通過I型膠原酶消化,得到脂肪成體干細胞;穩(wěn)定傳代后,分別用含1%、10% FBS的軟骨誘導液干預ADASCs 2周,采用MTT檢測方法對細胞增殖活性進行比較,應用甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色進行軟骨細胞鑒定,利用Leica病理圖像軟件分析兩組間Ⅱ型膠原免疫組化染色后的灰度,比較兩組細胞分化的效果。 2、TGF-β1誘導ADASCs體外構建改良纖維蛋白膠軟骨模塊:取傳3代的ADASCs,消化、離心后,棄上清液,實驗組(FG/HA組)加入100μL纖維蛋白膠(FG)催化劑液,將細胞與之混勻,再分別加入200μL透明質酸(HA)及100μL FG主體膠液,充分混勻,待其在室溫下成凝膠狀后移入24孔培養(yǎng)板中,加入誘導液培養(yǎng)。對照組(FG組)中不加HA,只加入200μL FG催化劑液和200μL主體膠液,其它操作同實驗組。倒置顯微鏡逐日觀察兩組細胞生長情況以及支架降解情況;第14 d取出標本,2.5%戊二醛固定,掃描電鏡下分別觀察FG組及FG/HA組細胞與支架材料復合情況;10%中性甲醛溶液固定其余標本,石蠟包埋,切片,行HE染色、甲苯胺藍染色,免疫組化法檢測Ⅱ型膠原的表達。 結果:MTT檢測顯示10%FBS組細胞增殖活性高于1%FBS組(P0.05),兩組細胞的甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色均為陽性,并以10%FBS組更為顯著;灰度分析提示10%FBS組Ⅱ型膠原表達量高于1%FBS組(P0.05)。脂肪成體干細胞在支架內呈多層的三維生長,形態(tài)為圓形,增殖活性高。誘導培養(yǎng)后,兩組支架材料均有降解,但實驗組較對照組的降解速度明顯減慢。掃描電鏡可見FG/HA復合支架呈三維立體多孔結構,孔隙率較高,細胞與支架材料附著情況良好。石蠟切片HE染色可見類似正常軟骨的組織學特征,甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性,實驗組的陽性染色程度較高。 結論:在體外單層培養(yǎng)的條件下,ADSASCs可以定向誘導分化為軟骨細胞,含10%FBS的軟骨誘導液更有利于脂肪成體干細胞向軟骨細胞方向增殖和分化。體外培養(yǎng)系統(tǒng)中,纖維蛋白膠/透明質酸(FG/HA)復合支架生物相容性好,孔隙率較高,且有效解決了FG降解速度過快的問題,是一種較為理想的軟骨組織工程載體材料。三維環(huán)境下培養(yǎng)更有利于干細胞向軟骨細胞方向分化,而且有利于軟骨細胞表型的維持。
[Abstract]:The injury and defect of articular cartilage is one of the common problems. Department of orthopedics, articular cartilage regeneration and self repair ability is very limited, and the traditional treatment methods such as drilling and grinding operation, micro fracture have some defects, the long-term curative effect is not ideal. In recent years the development of tissue engineering technology in order to solve this problem brought new hope, is expected to become a new method for the treatment of cartilage injury. Cartilage tissue engineering areinoculated seed cells into suitable biomaterial scaffolds and induced in vitro directly or after implantation to repair cartilage defect in vivo. Therefore, seed cells and scaffold materials plays an important role in the construction of tissue engineered cartilage.
Objective: to isolate adipose derived adult stem cells from rabbit adipose tissue (ADASCs), in vitro and cultured after transforming growth factor beta 1 (TGF- beta 1) in the presence of comparing the effects of different concentrations of serum on the proliferation and differentiation of ADASCs to chondrocytes, explore the serum concentration appropriate; then passaged after ADASCs transplantation on fibrin glue / hyaluronic acid (FG/HA) composite scaffold in cartilage, containing TGF- beta 1 induced cultured fluid, in vitro ADASCs, fibrin glue / hyaluronic acid and transforming growth factor for cartilage tissue engineering module, as of FG/HA the feasibility of scaffold materials for cartilage tissue engineering.
Methods: 1, ADASCs in the serum of different concentrations of chondrogenic differentiation: adult New Zealand rabbits neck fat tissue, cut by type I collagenase digestion, obtained adipose derived adult stem cells; stable after passage, respectively with 1%, 10% FBS of cartilage induced liquid ADASCs 2 week intervention, using MTT detection method to compare the activity of cell proliferation, toluidine blue staining and type II collagen immunohistochemical staining of cartilage cell identification, analysis of two groups of type II collagen immunohistochemical staining using Leica pathological image gray software, compared with two groups of cell differentiation.
2, TGF- beta 1 induced by ADASCs in vitro improved fibrin glue bracket: the 3 generation of ADASCs, digestion, after centrifugation, the supernatant was removed, the experimental group (group FG/HA) with 100 L fibrin glue (FG) catalyst liquid, mixing with the cells, then adding 200 L transparent hyaluronic acid (HA) and 100 L FG body glue, mixing, to the gel at room temperature after moving into the 24 hole culture plate, adding induction medium. The control group (FG group) without HA, adding only 200 L FG and 200 L the main catalyst liquid glue the other solution, the same as the experimental group. The inverted microscope daily observation two groups of cells and scaffold degradation of growth; fourteenth D specimens were fixed in 2.5% glutaraldehyde and were observed in FG group and FG/HA group of cells and scaffold material composite by scanning electron microscope; 10% neutral Formaldehyde Solution other specimens were fixed, paraffin embedded, sliced, HE staining, toluidine blue staining, free The expression of type II collagen was detected by the Phytophthora histochemical method.
Results: MTT showed that 10%FBS group cell proliferation activity is higher than that of 1%FBS group (P0.05), toluidine blue staining and type II collagen immunohistochemical staining of cells in two groups were positive, and the 10%FBS group was more significant; gray analysis showed that in 10%FBS group, the expression of type II collagen was higher than that of group 1%FBS (P0.05) adipose derived adult stem. The growth of three-dimensional cell layers within the scaffold, shape is round, the proliferation activity is high. After induction, two groups of scaffold materials were degraded, but the experimental group than in the control group decreased significantly. The degradation speed of scanning electron microscopy showed that the FG/HA composite scaffold showed a three-dimensional porous structure, high porosity, good adhesion of cells and scaffold material features. HE staining of the paraffin sections showed similar to normal cartilage tissue, toluidine blue staining and type II collagen immunohistochemical staining, the experimental group of the high degree of positive expression.
Conclusion: in vitro monolayer culture conditions, ADSASCs can differentiate into cartilage cells containing 10%FBS cartilage induced liquid is more conducive to the proliferation of adipose derived adult stem cell differentiation and chondrogenic. The in vitro culture system, fibrin glue / hyaluronic acid (FG/HA) composite scaffold has good biocompatibility, high porosity, and effectively solves the problem of excessive degradation rate of FG, which is an ideal carrier material for cartilage tissue engineering. More conducive to the differentiation of stem cells into chondrocytes cultured in 3D environment, but also beneficial to maintain the phenotype of chondrocytes.

【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R329

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