本文選題：RAB24　切入點(diǎn)：表達(dá)譜分析　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2005年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：Rab蛋白組成了Ras超家族(即小G蛋白)的一個(gè)大家族,主要參與胞內(nèi)膜泡運(yùn)輸過程,對(duì)蛋白的分揀、運(yùn)輸和定位起著非常重要的作用。目前雖然有些Rab蛋白在膜泡運(yùn)輸中的調(diào)控機(jī)制已經(jīng)比較明了,但大多數(shù)Rab家族成員的具體作用仍不清楚。作為Rab家族的一個(gè)非典型成員,Rab24有不少性質(zhì)與其他成員截然不同。目前有關(guān)小鼠的Rab24基因的研究很少,僅有初步的功能探索,還沒有明確地闡明它具體參與了什么信號(hào)途徑,并在這些途徑中起了什么作用。而人的RAB24基因雖于2002年在NCBI數(shù)據(jù)庫中釋放,至今并無功能方面的研究。我們從本實(shí)驗(yàn)室已建立的人全長(zhǎng)cDNA文庫的序列分析中獲得了RAB24基因并對(duì)其進(jìn)行初步的功能研究。現(xiàn)將主要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果羅列如下: (1) 生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),目前RAB24基因共有四種不同的剪接體,EST分析和RT-PCR實(shí)驗(yàn)都表明這四個(gè)剪接體在人的多種組織中都是普遍表達(dá)的。 (2) 亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,在AD293細(xì)胞系中,RAB24定位于細(xì)胞質(zhì),且在核周位置較為集中,這與以前的報(bào)道結(jié)果一致;有趣的是,在其它實(shí)驗(yàn)室未曾選用的COS7細(xì)胞系中,該蛋白意外地定位在細(xì)胞核中,僅有少部分定位在核外周。這種定位的不同暗示著Rab24基因在人和猴子中應(yīng)該具有某些不同的功能。 (3) 突變體RAB24(D1231)在COS7細(xì)胞中形成了非常明顯的包涵體,包涵體集中分布在核外周,這與已報(bào)道的該突變體在其他細(xì)胞系中的定位模式似乎正好相反。 (4) 在AD293細(xì)胞中,突變體RAB24(G66D)、RAB24(T120N)和RAB24(HH202II)與野生型RAB24的定位模式有所不同,轉(zhuǎn)為明顯的全細(xì)胞定位,且細(xì)胞核中分布較多,這說明RAB24應(yīng)當(dāng)存在一種不同于其它RAB蛋白的定位機(jī)制。突變體RAB24(Y17A)和RAB24(S67Q)則與野生型RAB24定位模式無明顯差異。 (5) 通過酵母雙雜交系統(tǒng)的篩選,我們找到了與RAB24相互作用的重要蛋白CYCLOPHILINA、GABARAP。酵母菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)和熒光共定位實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這種相互作用是真實(shí)存在的。依次,我們對(duì)RAB24可能具有的功能做進(jìn)一步的探討。 (6) GTPase活性測(cè)定表明,人RAB24與小鼠Rab24一樣,活性非常低。而它的兩個(gè)定點(diǎn)突變體RAB24(Y7A)和RAB24(S67Q)的酶活則有非常顯著的增高,這說明這兩個(gè)位點(diǎn)的存在是造成其酶活性低的重要原因之一。
[Abstract]:Rab proteins form a large family of Ras superfamily (small G protein), mainly involved in the transport of endocytic vesicles and the sorting of proteins. Transport and localization play a very important role. Although the regulatory mechanism of some Rab proteins in membrane vesicle transport has been relatively clear, However, the role of most members of the Rab family is still unclear. As an atypical member of the Rab family, Raban24 has quite a number of properties that are quite different from those of other members. At present, there are few studies on the Rab24 gene in mice, and only a preliminary study of its function. It is not clear what signaling pathways it is involved in and what role it plays in those pathways. The human RAB24 gene was released in the NCBI database on 2002. Up to now, we have obtained the RAB24 gene from the sequence analysis of the human full-length cDNA library established in our laboratory and carried out a preliminary functional study. The main experimental results are listed as follows:. 1. Bioinformatics analysis showed that there were four different splicing bodies in RAB24 gene. The results of EST analysis and RT-PCR experiments showed that the four splicing bodies were universally expressed in various human tissues. The results of subcellular localization showed that RAB24 was located in the cytoplasm of AD293 cell lines and was more concentrated around the nucleus, which was consistent with previous reports. Interestingly, it was found in COS7 cell lines that had not been selected in other laboratories. The protein was accidentally located in the nucleus, with only a small number of the proteins located around the nucleus, suggesting that the Rab24 gene should have some different functions in humans and monkeys. The mutant RAB24D1231) formed a very obvious inclusion body in COS7 cells, and the inclusion bodies were concentrated around the nuclear periphery, which appeared to be the opposite of the reported localization pattern of the mutant in other cell lines. (4) in AD293 cells, the localization patterns of the mutants RAB24G66DNand RAB24H2022) were different from those of wild-type RAB24, and transformed into obvious whole-cell localization, and the distribution of RAB24G66DG-T120Nand RAB24H202II was much more than that of wild-type RAB24. This suggests that RAB24 should have a different localization mechanism from other RAB proteins, while the mutant RAB24AY17A and RAB24S67Q) have no significant difference from wild type RAB24. Through the screening of yeast two-hybrid system, we found the important protein CYCLOOPHILINA GABARAPP interacting with RAB24. The yeast binding experiment and fluorescence co-localization experiment confirmed that the interaction was real. We further explore the possible functions of RAB24. The detection of GTPase activity showed that the activity of human RAB24 was very low as that of mouse Rab24, but the enzyme activity of its two site-directed mutants RAB24OY7A and RAB24S67Q) was significantly increased, which indicated that the existence of these two sites was one of the important reasons for the low enzyme activity.
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：Q75

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1608622