發(fā)布時間：2018-03-11 15:41

  本文選題：變形桿菌　切入點(diǎn)：耐藥　出處：《第一軍醫(yī)大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景 疫苗的誕生為人類防治疾病帶來了革命性的變化。實(shí)踐證明，免疫預(yù)防是預(yù)防和控制傳染病最經(jīng)濟(jì)、最簡便、最有效的手段。繼20世紀(jì)80年代成功地消滅天花后，隨著免疫學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，疫苗的研制取得了長足進(jìn)步�；仡櫼呙绲陌l(fā)展歷史，從其生產(chǎn)的技術(shù)角度，可分為傳統(tǒng)疫苗和新型疫苗兩類。傳統(tǒng)疫苗(classic vaccine)是直接將無毒或減毒的病原體作為疫苗接種到人或動物體內(nèi)，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，從而預(yù)防疾病的發(fā)生。新型疫苗是用遺傳重組、基因工程、蛋白質(zhì)工程等現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)的疫苗，具有傳統(tǒng)疫苗無可比擬的優(yōu)點(diǎn)。但由于一些問題的存在，新型疫苗在短期內(nèi)仍不可能代替目前廣泛使用的傳統(tǒng)疫苗。而對于細(xì)菌、病毒感染性疾病等，細(xì)菌疫苗仍是重要的研究方向。特別是隨著抗生抗生素的廣泛應(yīng)用和不合理的使用，耐藥及多重耐藥細(xì)菌已經(jīng)嚴(yán)重威脅著人類和動物的健康。從細(xì)菌染色體、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等遺傳學(xué)和產(chǎn)生滅活酶、主動外輸、滲透屏障、代謝、靶位改變和生物被膜形成等生物化學(xué)方面誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制�？朔�(xì)胞細(xì)菌耐藥，嚴(yán)格控制抗生素的使用，開發(fā)一些天然抗菌肽和特異的細(xì)菌疫苗，以控制感染，是近年來對一些傳染性和多藥耐藥感染性疾病治療的重要研究方向。目前國際上在用的細(xì)菌疫苗約有15種，其中載入我國規(guī)程的有12科，分別是霍亂疫苗、傷寒疫苗、痢疾疫苗、百日咳疫苗、流腦多糖疫苗、b型流感嗜血桿菌疫苗、肺炎多糖疫苗、鉤端螺旋體疫苗、萊姆病疫苗、卡介苗、鼠疫疫苗、布氏菌病疫苗、炭疽疫苗，在臨床應(yīng)用中取得了一定的療效。目前，其它菌苗也有相繼報道。 本研究采用變形桿菌作為免疫原研究。變形桿菌(proteus species)是一類大小、形態(tài)不一的細(xì)菌，有時球形，有時絲狀，呈明顯的多形性，周身鞭毛，能運(yùn)動且運(yùn)動活潑，無芽孢莢膜，需氧及兼性厭氧，屬革蘭氏陰性菌。變形桿菌廣泛存在于水、土壤腐敗的有機(jī)物以及人和動物的腸道中，為條件致病菌，多為繼發(fā)感染，如慢性中耳炎、創(chuàng)傷感染等，也可引起膀胱炎、嬰兒腹瀉、食物中毒等。變形桿菌屬包括普通突變形桿菌、奇異變形桿菌、莫根變形桿菌、雷極變形桿菌和無恒變形桿菌。其中以普通變形桿菌和奇異變形桿菌與臨床關(guān)系較密切。特別是奇異變形桿菌可引起敗血癥，病死率較高。因此，控制變形桿菌引起的疾病對于臨床感染性疾病治療具有十分重要意義。作為菌苗控制疾病的主要機(jī)制在于其刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答，釋放細(xì)胞因子和產(chǎn)生抗體，對細(xì)菌或病毒產(chǎn)生破壞或溶解。隨著淋巴細(xì)胞激活的信號途徑研究的不斷深入，樹突細(xì)胞在抗原遞呈和免疫反應(yīng)中的起著十分重要的作用。而乙肝在我國發(fā)病率較高，是肝癌和終木期肝病的重要病因，經(jīng)研究乙肝病人樹突細(xì)胞免疫信號分子表達(dá)和細(xì)胞免疫、體液免疫與健康人相比存在明顯異常。為此，本研究選擇乙肝病人外周血中樹突細(xì)胞信號分子表達(dá)、細(xì)胞因子分泌，以及小鼠脾細(xì)胞增殖、脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子等體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，探討變形桿菌對樹突細(xì)胞信號分子的表達(dá)和細(xì)胞免疫、體液免疫的影響，為變形桿菌應(yīng)用于菌苗奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 目的 本研究采用腸道菌選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基分離泌尿系統(tǒng)反復(fù)感染患者的尿液樣本中的變形桿菌，經(jīng)進(jìn)一步鑒定和傳代減毒后感染小鼠，分析脾細(xì)胞體外增殖能力和脾細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ水平及抗體變化；并通過流式細(xì)胞儀、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)分析乙肝病人外周血樹突細(xì)胞信號分子表達(dá)和IFN-γ水平變化，探討變形桿菌對細(xì)胞免疫和體液免疫的影響，為變形桿菌菌苗研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法 1．留取泌尿系統(tǒng)反復(fù)感染患者的尿液樣本，將所取樣品用分區(qū)劃線法分別接種于腸道菌選擇培養(yǎng)基(S，S瓊脂)及鑒別培養(yǎng)基(伊紅美藍(lán)瓊脂)平皿中，置37℃溫箱培養(yǎng)18～24小時后，觀察菌落特征，在培養(yǎng)后的平皿中找到符合變形桿菌菌落特點(diǎn)的菌落。將挑出的菌落做進(jìn)一步的鑒定。 2．用Blendon鍍銀染色后觀察、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基試驗(yàn)、動力靛基質(zhì)尿素酶試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)對挑出的菌落作初步鑒定。 3．從泌尿系統(tǒng)反復(fù)感染患者的尿液樣本中分離的變形桿菌通過特殊的處理，將原有的毒性減低，并做毒性試驗(yàn)以證明其毒性的降低。再用三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基試驗(yàn)、動力靛基質(zhì)尿素酶試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、遷徙生長試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、液化明膠試驗(yàn)、西蒙枸櫞酸鹽試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、氨基酸脫羧酶試驗(yàn)、糖(醇、苷)類發(fā)酵試驗(yàn)(麥芽糖、木糖)、對氯霉素的敏感性試驗(yàn)對特殊處理后的菌種進(jìn)行最后鑒定。鑒定無誤后將經(jīng)特殊處理的菌種接種、培養(yǎng)、采集、殺菌、離心、純化，稀釋成2×10~(11)／mL的原液，并對原液進(jìn)行無菌試驗(yàn)和原液檢定。 4．將變形桿菌原液用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成2×10~(10)／mL。采集慢性乙型肝炎患者和健康人肝素抗凝外周血，分離外周血單個核細(xì)胞，并體外定向誘導(dǎo)分化和培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞。對照組為RPMI-1640培養(yǎng)基(含10％小牛血清)500μL+培養(yǎng)的樹突細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組為RPMI-1640培養(yǎng)基(含10％小牛血清)500μL+培養(yǎng)的樹突細(xì)胞+變形桿菌稀釋液，用流式細(xì)胞儀檢測CD80，CD86的表達(dá)水平。 5．將變形桿菌原液用蒸餾水稀釋成2×10~9／mL，腹腔接種BALB／C小鼠。采用~3H-TdR攝入法檢測小脾細(xì)胞經(jīng)PHA、變形桿菌、ConA體外培養(yǎng)后脾增殖能力的變化；用ELISA法檢測鼠血清抗體水平；并通過ELISA檢測試劑盒檢測脾細(xì)胞加入變形桿菌培養(yǎng)后IFN-γ和IL-2濃度。 6．取肝素抗凝外周血制備人外周血淋巴細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為五組，分別為只加入培養(yǎng)基、HBcAg、HBcAg+變形桿菌培養(yǎng)液、HBsAg、HBsAg+變形桿菌培養(yǎng)液，用ELISPOT檢測五組外周血淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ。 結(jié)果 (一)耐藥變形桿菌的分離、鑒定和生產(chǎn) 1．分離的細(xì)菌符合變形桿菌的菌落特征 2．初步鑒定證明所分離細(xì)菌可能是普通變形桿菌三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基呈黑色，并產(chǎn)生H_2S氣體；動力靛基質(zhì)尿素酶試驗(yàn)結(jié)果為動力陽性、靛基質(zhì)陽性、尿素酶試驗(yàn)陽性；苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)出現(xiàn)綠色，結(jié)果為陽性。 3．最后鑒定證明所分離細(xì)菌是普通變形桿菌毒性試驗(yàn)結(jié)果說明經(jīng)傳代培養(yǎng)后變形桿菌的毒性出現(xiàn)顯著下降(傳代培養(yǎng)前后LD_(50)分別為1.35×10~6和7.92×10~7)。三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基試驗(yàn)+、動力靛基質(zhì)尿素酶試驗(yàn)+、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)+、遷徙生長+、硫化氫產(chǎn)生+、液化明膠+、西蒙枸櫞酸鹽d、吲哚試驗(yàn)+、氨基酸脫羧酶一、麥芽糖+、木糖+、對氯霉素敏感性R，，證明原始菌種為普通變形桿菌。將原始菌種制成2×10~(11)／mL的變形桿菌原液。 (二)變形桿菌能顯著提高體外培養(yǎng)的慢性乙型肝炎患者樹突狀細(xì)胞CD80，CD86陽性細(xì)胞百分率 通過體外分離HBV感染病人和健康人外周血樹突細(xì)胞，正常人的CD80，CD86的表達(dá)陽性百分率均大于慢性乙型肝炎病人(P=0.000，P=0.000)；經(jīng)變形桿菌培養(yǎng)48h后，慢性乙肝病人CD80，CD86的表達(dá)率顯著增加(P=0.000，P=0.000)，而健康人的CD80、CD86表達(dá)陽性百分率改變不顯著(P=0.185，P=0.118)。 (三)變形桿菌對小鼠免疫有一定的影響 1．變形桿菌能夠增加小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力 小鼠經(jīng)變形桿菌液腹腔種后(1次／周，2周)，采用~3H-TdR攝入法檢測，經(jīng)PHA或變形桿菌培養(yǎng)后，與對照組相比小鼠淋巴細(xì)胞均出現(xiàn)顯著的增殖反應(yīng)(PHA組t=-27.860，P=0.000；變形桿菌組t=-14.630，P=0.000)。采用變形桿菌和ConA共同與脾細(xì)胞培養(yǎng)后，三種不同劑量的變形桿菌刺激后脾細(xì)胞增殖反應(yīng)與對照組相比均具有顯著差異(0.5mL實(shí)驗(yàn)組、1mL實(shí)驗(yàn)組、2mL實(shí)驗(yàn)組均為P=0.000)。 2．變形桿菌對小鼠外周血抗體IgG2a的影響對變形桿菌接種小鼠后血清IgG抗體亞型IgG2a進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明：三個實(shí)驗(yàn)組小鼠變形桿菌均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生IgG2a抗體；與對照組相比均具有顯著差異(0.25mL實(shí)驗(yàn)組P=0.015，0.5mL實(shí)驗(yàn)組和1mL實(shí)驗(yàn)組P=0.000)。 3．變形桿菌能夠增加小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2不同劑量(0.1mL、0.3mL、0.9mL)變形桿菌接種小鼠后，取脾細(xì)胞與變形桿菌培養(yǎng)48 h后，不同劑量實(shí)驗(yàn)組較對照組(腹腔注射生理鹽水)產(chǎn)生細(xì)胞因子IFN-γ顯著增加(三組均為P=0.000)，而以0.9mL實(shí)驗(yàn)組增加最為顯著(與0.1mL組、0.3mL組比均為P=0.000)；不同劑量實(shí)驗(yàn)組較對照組(腹腔注射生理鹽水)產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-2顯著增加(三組均為P=0.000)，而以0.9mL實(shí)驗(yàn)組增加最為顯著(與0.1mL組、0.3mL組比均為P=0.000)。 (四)變形桿菌可促進(jìn)慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ分離乙肝病人外周血淋巴細(xì)胞，采用ELISPOT方法檢測HBV患者外周血淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ。結(jié)果顯示：HBcAg+變形桿菌實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)顯著高于HBcAg實(shí)驗(yàn)組(P=0.031，x~2=0.797)，HBsAg+變形桿菌實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)也顯著高于HBsAg實(shí)驗(yàn)組(P=0.048，x~2=1.033)。結(jié)論 (一)通過腸道選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基分離反復(fù)尿路感染病人尿中變形桿菌，方法可靠，經(jīng)進(jìn)一步鑒定和傳代后毒力明顯下降。 (二)變形桿菌能夠顯著增加乙肝病人外周血中樹突細(xì)胞CD80和CD86陽性細(xì)胞百分率，對正常人外周血中樹突細(xì)胞CD80和CD86表達(dá)的陽性細(xì)胞百分率并不增加。 (三)變形桿菌腹腔感染小鼠后，能夠增加脾細(xì)胞的體外增殖能力和脾細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ水平。 (四)變形桿菌可促進(jìn)慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R378

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本文編號：1598820