本文選題：壓應(yīng)力　切入點(diǎn)：增生性瘢痕　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 機(jī)械應(yīng)力作用于活體細(xì)胞,研究其受應(yīng)力作用后的各種變化,是近十年來細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)展十分迅速的研究方法。業(yè)已證明,人體細(xì)胞生長在機(jī)體提供的微動(dòng)力學(xué)環(huán)境中,機(jī)械應(yīng)力不僅能引起細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化,還能調(diào)控細(xì)胞的功能狀態(tài),影響細(xì)胞的增殖、分化及凋亡,在某些生理和病理過程中起著重要作用。目前研究較多的集中在生理、病理?xiàng)l件以及治療過程中受到機(jī)械應(yīng)力作用的細(xì)胞,如骨細(xì)胞(研究骨延長技術(shù)、加壓固定治療骨折技術(shù)、骨質(zhì)疏松癥機(jī)制等)、血管平滑肌細(xì)胞(研究高血壓發(fā)病機(jī)制)、腎小球系膜細(xì)胞(研究腎小球高血壓)、椎間盤細(xì)胞(研究椎間盤突出癥)以及各類干細(xì)胞等,并取得了長足的進(jìn)展。增生性瘢痕(Hyperplastic Scar,HS)是臨床上的常見病、多發(fā)病。由于其發(fā)病機(jī)制不明,治療遂缺乏有效手段。HS的組織學(xué)研究證實(shí),大量排列紊亂的成纖維細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積是構(gòu)成HS的重要基礎(chǔ),因而對其成纖維細(xì)胞的研究是目前HS防治研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)。 有關(guān)HS的治療,目前臨床上均采用綜合治療,其中壓迫療法對早期HS的治療有效已在臨床上達(dá)成共識,但就其治療所提供壓應(yīng)力的大小、治療時(shí)機(jī)、持續(xù)時(shí)間以及相關(guān)的分子機(jī)制尚不十分明確。既往研究提示,壓應(yīng)力對HS的血供能產(chǎn)生影響,導(dǎo)致HS組織缺血(或淤血)、缺氧,從而抑制HS的生長。然而對壓應(yīng)力條件下增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(HSFb)本身生物學(xué)特性的改變上尚關(guān)注甚少。為此,深入認(rèn)識壓應(yīng)力對HSFb形態(tài)、增殖、凋亡的影響,以及相關(guān)分子機(jī)制,無疑對臨床上更加合理的運(yùn)用壓迫療法治療HS提供重要的理論基礎(chǔ)。 本研究擬以人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(Human Hyperplastic Scar Fibroblast,HHSFb)為對象,通過自行研發(fā)的簡易氣控加壓細(xì)胞培養(yǎng)儀(國家發(fā)明專利受理號:20061006717178.3),予細(xì)胞施加不同大小,持續(xù)不同時(shí)間的壓應(yīng)力,采用多學(xué)科的技術(shù)和方法,觀察HHSFb生長特性(形態(tài)、增殖、凋亡)的變化,并初步探討其量效關(guān)系及相關(guān)分子機(jī)制。 方法 1)應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法獲取HHSFb。以簡易氣控加壓細(xì)胞培養(yǎng)儀予細(xì)胞施以5、10、15、25、50、100、150mmHg的持續(xù)壓應(yīng)力(每組n=6)4天,不施壓設(shè)為對照組(n=6)。分別以四甲基偶氮唑(MTT)法測定細(xì)胞A值并計(jì)算其生長抑制率、流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞生長周期及Annexin-V-PI標(biāo)記法測定細(xì)胞凋亡情況。 2)將HHSFb隨機(jī)分為對照組(未施壓)、持續(xù)施壓組(25 mmHg,6～8天)和施壓(25mmHg,3～4天)后去除壓應(yīng)力組。分別以MTT法測定細(xì)胞生長抑制率、流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞生長周期、免疫組化觀察增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)及Annexin-V-PI標(biāo)記法測定細(xì)胞凋亡情況。 3)將HHSFb隨機(jī)分為對照組(未施壓)、持續(xù)施壓組(25 mmHg,12h),提取蛋白應(yīng)用免疫印跡法(Westernblot)測定HHSFb信號傳導(dǎo)分子p38MAPK磷酸化和Caspase-3活化情況。 結(jié)果 1)5mmHg、10mmHg壓應(yīng)力組細(xì)胞A值(0.228±0.004,0.226±0.003)、DNA合成前期(G1期)細(xì)胞百分比(71.80±0.44%,72.32±0.40%)與對照組細(xì)胞A值(0.230±0.005)、G1期細(xì)胞百分比(71.46±0.49%)相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);但15、25、50、100、150mmHg壓應(yīng)力組細(xì)胞A值(0.213±0.005、0.180±0.005、0.172±0.007、0.165±0.004、0.164±0.004),G1期細(xì)胞百分比為(74.56±1.01%,82.82±2.76%、86.77±2.06%、88.23±1.27%、89.11±1.74%)與對照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);其中10、15、25、50壓應(yīng)力組組間比較差異顯著(P＜0.01),細(xì)胞增殖抑制率、G1期細(xì)胞百分比與壓應(yīng)力大小呈正相關(guān);50、100、150mmHg壓應(yīng)力組的上述結(jié)果組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),細(xì)胞抑制率、G1期細(xì)胞百分比隨壓應(yīng)力增加增長不明顯。5mmHg、10mmHg壓應(yīng)力組細(xì)胞早期凋亡率(4.22±0.49%,5.12±0.74%)與對照組(4.00±0.36%)相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);但15、25、50、100、150mmHg壓應(yīng)力組細(xì)胞早期凋亡率(8.58±0.79%、19.28±1.40%、25.60±1.21%、35.80±2.39%、36.18±2.3%)與對照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);其中10、15、25、50、100壓應(yīng)力組組間比較差異顯著(P＜0.01),細(xì)胞凋亡率與壓應(yīng)力大小呈正相關(guān)并隨壓力增加細(xì)胞凋亡率顯著增強(qiáng);100、150mmHg壓應(yīng)力組的上述結(jié)果組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),細(xì)胞早期凋亡率隨壓應(yīng)力增加增長不明顯。 2)25 mmHg持續(xù)壓應(yīng)力對HHSFb的生長抑制率隨加壓時(shí)間的延長逐漸增大;與對照組相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)比較,PCNA表達(dá)降低,處于增殖期(S+G_2+M)細(xì)胞比例減小;細(xì)胞凋亡率隨施壓時(shí)間延長逐漸增加;而施壓后去除壓應(yīng)力繼續(xù)培養(yǎng)觀察顯示,HHSFb的抑制率逐漸回降,PCNA表達(dá)增加和增殖期(S+G_2+M)細(xì)胞比例“反彈”增大,細(xì)胞的凋亡率也逐漸下降。 3)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞持續(xù)施壓12h后,p38MAPK的磷酸化和Caspase-3活化明顯增強(qiáng)。 結(jié)論 壓應(yīng)力(大于15 mmHg)對人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞具有直接抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的復(fù)合效應(yīng),其中p38MAPK和Caspase-3是增生性瘢痕成纖維細(xì)胞壓應(yīng)力效應(yīng)的重要信號分子。結(jié)合臨床上壓迫療法具體運(yùn)用的綜合考慮,25 mmHg左右的壓力可能較為適宜,但不宜超出50mmHg,且需要早期、持續(xù)和長期維持。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R329;R622

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本文編號：1587265