本文選題：高遷移率族蛋白B1　切入點(diǎn)：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的:高遷移率族蛋白B1(HMGB1)作為一種晚期炎癥介質(zhì),介導(dǎo)了膿毒癥和其他系統(tǒng)性炎癥的致死性。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察體外刺激小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)變化規(guī)律,進(jìn)而闡明HMGB1對該細(xì)胞免疫功能的影響并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討。旨在為進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及感染后期嚴(yán)重膿毒癥的預(yù)防和治療提供新思路。 方法:斷頸處死小鼠無菌取脾臟,分離單個核細(xì)胞。①采用免疫磁珠法分離獲取正常BALB/c小鼠脾臟CD4~+T,CD4~+CD25~-T細(xì)胞及CD4~+CD25~Treg,鑒定細(xì)胞純度。②分別以植物凝集素(PHA)、刀豆素A(Con A)及固相包被抗-CD3這三種不同的刺激劑誘導(dǎo)活化Treg,觀察T淋巴細(xì)胞毒性相關(guān)抗原4(cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen 4,CTLA-4)及叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/wingedhelix transcription factor,Foxp3)表達(dá)的時間-效應(yīng)關(guān)系。③將Treg依HMGB1(100ng/ml)刺激時間不同設(shè)為24 h組、48 h組、72 h組觀察HMGB1刺激與CTLA-4及Foxp3表達(dá)的時間-效應(yīng)關(guān)系。將Treg依HMGB1濃度不同設(shè)為0ng/ml組(對照組)、10ng/ml組、100ng/ml組、1000ng/ml組,72h后用流式細(xì)胞儀分析CTLA-4、Foxp3表達(dá)情況及對IL-10分泌的影響(劑量-效應(yīng)關(guān)系)。④分別提取CD4~+CD25~+Treg及CD4~+CD25~-T細(xì)胞,設(shè)單純CD4~+CD25~-對照組,另依CD25~+:CD25~-比例分設(shè)1:1組、1:5組、1:10組、1:20組,通過MTT比色試驗(yàn)檢測CD4~+CD25~+Treg對CD4~+CD25~-T細(xì)胞抑制的細(xì)胞比例關(guān)系。⑤HMGB1刺激Treg 72h。刺激后細(xì)胞依CD25~+:CD25~-比例設(shè)1:1及1:5組。各組分設(shè)CD25~-組、未刺激Treg組及HMGB1-Treg組。通過MTT比色試驗(yàn)分析HMGB1刺激對Treg細(xì)胞抑制功能的影響。⑥SYBR GREEN法測定HMGB1刺激與Foxp3基因表達(dá)的時間、劑量-效應(yīng)關(guān)系。⑦分別留取細(xì)胞培養(yǎng)上清,ELISA法測定不同細(xì)胞因子的變化情況。 結(jié)果:1.小鼠CD4~+CD25~+Treg純度分析:多次細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)證實(shí),正常小鼠脾臟單個核細(xì)胞經(jīng)過MACS兩次分選后,CD4~+CD25~+T細(xì)胞純度可達(dá)到91.74%～98.14%,其中CD25細(xì)胞低于3%;CD4~+CD25~-T細(xì)胞純度達(dá)88.73%～93.85%,其中CD25~+細(xì)胞少于1%。所獲得的CD4~+CD25~+T細(xì)胞經(jīng)臺盼藍(lán)檢測活性大于97%。2.PHA對于CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞無明顯活化作用,CTLA-4及Foxp3表達(dá)與對照組比較平均熒光強(qiáng)度沒有明顯差異(P＞0.05)。而Con A刺激Treg CTLA-4的表達(dá)上調(diào)呈一過性,作用持續(xù)時間不超過48 h,且對于Foxp3的表達(dá)也無明顯的影響�？�-CD3則能夠較好地活化Treg,表現(xiàn)為CTLA-4及Foxp3表達(dá)在24～72 h均明顯增強(qiáng)(P＜0.05或P＜0.01),其中24、48 h表達(dá)上調(diào)更為明顯(P＜0.01),并可延續(xù)至刺激后72 h。3.HMGB1刺激Treg,CTLA-4表達(dá)在24～72 h均有所下降(P＜0.05或P＜0.01),其中以作用48、72h表達(dá)下調(diào)尤為明顯(P＜0.01);而不同劑量HMGB1(10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml)刺激均可誘導(dǎo)CTLA-4表達(dá)下降(P＜0.05或P＜0.01),其中HMGB1濃度在1000ng/ml時其表達(dá)減弱最明顯。Foxp3表達(dá)與CTLA-4呈現(xiàn)出相同的趨勢。細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10水平呈現(xiàn)與HMGB1的劑量依賴關(guān)系,即HMGB1刺激濃度越高IL-10水平下降越明顯。4.CD4~+CD25~-T細(xì)胞在活化后表現(xiàn)出增殖反應(yīng),但隨Treg比例增加,CD4~+CD25~-T細(xì)胞增殖反應(yīng)抑制。當(dāng)細(xì)胞比例達(dá)到1:1時表現(xiàn)為對其抑制效應(yīng)達(dá)到90%左右。當(dāng)加入HMGB1(1000ng/ml)刺激的Treg時,CD4~+CD25~-T細(xì)胞增殖受抑程度減輕。這一現(xiàn)象在細(xì)胞比例為1:1及1:5組均表現(xiàn)出相同的趨勢。5.經(jīng)HMGB1刺激后的Treg Foxp3 mRNA表達(dá)分別于24～72h明顯下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01),其中以作用48、72h后表達(dá)下降尤為顯著(P＜0.01);給予HMGB1刺激72 h后,10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的HMGB1刺激均可誘導(dǎo)Foxp3表達(dá)減弱(P＜0.0或P＜0.01),其中HMGB1的濃度在1000 ng/ml時Foxp3表達(dá)下調(diào)最明顯。6.與正常對照組比較,不同時間及劑量HMGB1體外刺激Treg,其細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2水平均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。而細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10水平隨HMGB1刺激時間延長及濃度增高而下降明顯(P＜0.05或P＜0.01)。將CD4~+CD25~-T細(xì)胞中加入Treg共培養(yǎng)后,CD4~+CD25~-T細(xì)胞上清中IL-2、IFN-γ水平明顯下降,而當(dāng)加入HMGB1刺激的Treg后,隨HMGB1刺激濃度增加,二者生成受抑制的程度明顯逆轉(zhuǎn)(P＜0.05或P＜0.01)。與對照組相比,Treg組IL-4/IL-10生成明顯增加,而HMGB1-Treg組IL-4/IL-10水平下降并有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05或P＜0.01),且在HMGB1濃度為10ng/ml與100ng/ml時下降更為明顯(P＜0.01)。 結(jié)論:1.兩步法免疫磁珠分離CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞,所得細(xì)胞純度高,細(xì)胞活力無影響,完全可以滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的要求。2.在多種細(xì)胞刺激劑中,抗-CD3可以較好地活化Treg,為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供了可能。3.HMGB1可能通過下調(diào)細(xì)胞表面抑制性分子的表達(dá)及抑制性細(xì)胞因子的分泌兩條途徑下調(diào)Treg的功能,而Foxp3基因及蛋白表達(dá)的一致性說明HMGB1是通過抑制關(guān)鍵基因Foxp3表達(dá)機(jī)制進(jìn)而影響細(xì)胞免疫功能。4.HMGB1體外刺激不能改變Treg免疫無反應(yīng)性,Treg介導(dǎo)了Th1向Th2的漂移,但HMGB1弱化了Treg誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖、IL-2生成及功能性極化過程。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1586456