發(fā)布時間：2018-03-05 11:41

  本文選題：人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7　切入點(diǎn)：畢氏酵母　出處：《中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)是一種多功能蛋白，是轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-beta，TGF-β)超家族成員之一，為目前發(fā)現(xiàn)的一類具有異位成骨能力的細(xì)胞因子，它能刺激間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(hBMP-7)又稱為成骨蛋白-1(Osteogenic Protein-1，OP-1)，由于其具有較強(qiáng)的骨誘導(dǎo)能力而受到人們廣泛關(guān)注。它與Ⅰ型膠原蛋白的緩釋體移入骨干缺損部位，會導(dǎo)致有功能的新骨形成，顯示出應(yīng)用于骨與關(guān)節(jié)及軟骨缺損修復(fù)的前景。而且同時對神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)的分化發(fā)育也有調(diào)控作用。 hBMP-7基因編碼431個氨基酸，由N端的信號肽、中間區(qū)域的前肽和C端的成熟肽三部分組成，翻譯后的前體需要進(jìn)一步的加工修飾，包括切掉信號肽和前肽，其成骨活性主要表現(xiàn)在C端的成熟肽區(qū)。hBMP-7成熟肽含有139個氨基酸，單體分子量約15.7kD，帶有3個糖基化位點(diǎn)及7個半胱氨酸殘基。天然hBMP-7存在同源或異源二聚體形式，二聚體的hBMP-7是其生物學(xué)活性的主要形式。制備hBMP-7成熟肽主要的研究工作包括以下三個方面： 1．采用pMAL-p2x表達(dá)載體，在原核系統(tǒng)中獲得了hBMP7-MBP融合蛋白的可溶性高效表達(dá)，并通過親和純化得到純度約為80％的融合蛋白，利用Factor Xa蛋白酶對融合蛋白酶切后，得到目的蛋白hBMP-7成熟肽，以單體形式存在。 2．鑒于畢氏酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)能對重組蛋白進(jìn)行翻譯后必要的剪接、正確的折疊和修飾，糖基化形式更接近于高等真核生物，因此選用此表達(dá)系統(tǒng)，將hBMP-7成熟肽基因克隆入表達(dá)載體pPIC9K，用SalⅠ酶將重組質(zhì)粒線性化，電轉(zhuǎn)化入Pichia pastoris SMD1168細(xì)胞，G418抗性篩選出陽性整合子，，確定Mut~+表型進(jìn)行甲醇快速誘導(dǎo)，并對其培養(yǎng)和誘導(dǎo)條件進(jìn)行一定的探索和優(yōu)化。經(jīng)過整合子的篩選和表達(dá)條件的優(yōu)化，最終篩選到目的蛋白表達(dá)量占上清蛋白8％的分泌表達(dá)株，表達(dá)量為0.6mg／L，酶聯(lián)免疫檢測及蛋白印跡結(jié)果表明，表達(dá)的重組蛋白與抗hBMP-7抗體具有特異結(jié)合活性，提示重組表達(dá)蛋白具有天然蛋白的分子構(gòu)象。 3．為了提高目的蛋白的表達(dá)量，依據(jù)畢氏酵母的密碼子偏好性，對hBMP-7成熟肽基因進(jìn)行基因修飾，最終確定以含三個精氨酸突變位點(diǎn)的酵母菌作為表達(dá)株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)Ni-NTA柱純化得到純度為80％的蛋白樣品，基因修飾后的hBMP-7成熟肽在畢氏酵母中的表達(dá)水平提高了約4倍，產(chǎn)量為2.5mg／L。所得hBMP-7成熟肽在還原狀態(tài)下以分子量約18kD的單體形式存在，在非還原狀態(tài)下以二聚體形式存在，分子量約為36kD左右，重組蛋白經(jīng)PNGase F糖苷酶酶切分析證明其在畢氏酵母中發(fā)生了N糖基化。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)制備的hBMP-7成熟肽具有一定的生物學(xué)活性，能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 綜上所述，本研究利用畢氏酵母系統(tǒng)成功分泌表達(dá)了hBMP-7成熟肽，并能形成有生物學(xué)活性的二聚體形式，為今后hBMP-7的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Bone morphogenetic protein (Bone morphogenetic, proteins, BMPs) is a multifunctional protein, transforming growth factor (transforming growth factor-beta, TGF- beta) superfamily, is a type of the current found with cytokines of ectopic osteogenesis, it can stimulate mesenchymal cells to differentiate into osteoblasts. Human bone morphogenetic protein -7 (hBMP-7) also known as osteogenic protein -1 (Osteogenic Protein-1 OP-1), because of its strong ability of bone induction have received widespread attention. It and type I collagen release into the backbone of the defect site, will lead to new bone formation function, applied to the show repair of bone and joint cartilage defects and prospects. And at the same time on the nervous system, the differentiation and development of hematopoietic system also has a regulatory role.
The hBMP-7 gene encoding a 431 amino acid signal peptide N, by the end of the propeptide and the C end of the middle region of the mature peptide is composed of three parts, the precursor need further modification after translation, including cut off the signal peptide and peptide, its osteogenic activity is mainly manifested in the mature peptide of C end.HBMP-7 mature peptide monomer containing 139 amino acids, molecular weight of about 15.7kD, with 3 glycosylation sites and 7 cysteine residues. There are two natural hBMP-7 homologous or heterologous dimers form dimers with two hBMP-7 is the main form of its biological activity. The preparation work of hBMP-7 mature peptide mainly includes the following three aspects:
1. the pMAL-p2x expression vector, the soluble hBMP7-MBP fusion protein was highly expressed in prokaryotic system, and obtained by affinity purification of about 80% purity of fusion protein, fusion protein digested by Factor Xa protease, the target protein hBMP-7 mature peptide, a monomer.
2. in Pichia pastoris (Pichia pastoris) expression system can be translated to the recombinant protein necessary for splicing, correct folding and modification, glycosylated form closer to higher eukaryotes, so the use of this expression system, the hBMP-7 mature peptide gene was cloned into the expression vector pPIC9K. The recombinant plasmid Sal 1 enzyme linear electric pastoris was transformed into Pichia SMD1168 cells, G418 resistance screening positive for integron, determine Mut~+ phenotype of methanol induced rapid and carries on the exploration and optimization of culture and induction conditions. After optimizing the expression conditions and screening of integrons, the final screening to the target protein accounted for 8% of the supernatant protein the expression and secretion of strains, the expression level of 0.6mg / L, ELISA and Western blot results showed that the expression of recombinant protein with anti hBMP-7 antibody has a specific binding activity, suggesting that the recombinant protein A molecular conformation that has natural proteins.
3. in order to improve the expression level of target protein, according to codon preference of Pichia pastoris, gene modification of hBMP-7 mature peptide gene, determined by yeast containing three arginine mutation strains as were purified by Ni-NTA column chromatography, the purity was 80% protein samples, the expression level of gene modification after the hBMP-7 mature peptide in Pichia pastoris was improved about 4 times, the yield for the monomer form of 2.5mg / L. from hBMP-7 mature peptide in the reduced state with molecular weight of about 18kD, the reduced state to two dimer form of non molecular weight is about 36kD, the recombinant protein was PNGase F glycosidase enzyme analysis confirms the glycosylation of N in Pichia pastoris. Cytological experiments confirmed that the prepared hBMP-7 mature peptide with certain biological activity, can promote fibroblast cells to osteoblast like cells.
To sum up, this study successfully secreted hBMP-7 mature peptide by Pichia pastoris system, and formed a two mer form with biological activity, which laid the foundation for further research of hBMP-7 function.

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R341

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)會議論文 前10條

1 沈麗琴;徐疑;鄧忠彬;王鳳鳴;時文彪;張學(xué)光;;人可溶性4-1BBL1在畢氏酵母中的表達(dá)及其生物學(xué)特性的研究[A];中國免疫學(xué)會第四屆學(xué)術(shù)大會會議議程及論文摘要集[C];2002年

2 孫建軍;施勤;楊明峰;馬泓冰;周璇;張學(xué)光;;人可溶性O(shè)X40L在畢氏酵母中的表達(dá)[A];中國免疫學(xué)會第四屆學(xué)術(shù)大會會議議程及論文摘要集[C];2002年

3 袁景淇;任海濤;王明珠;任樂民;;基于模型的重組酵母碳源流加速率控制[A];第二十一屆中國控制會議論文集[C];2002年

4 吳德銘;于康震;畢英佐;曹永長;馬靜云;;E.acervulina廣東株3-1E基因酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2004學(xué)術(shù)年會暨第五屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會論文集（下冊）[C];2004年

5 宿曉云;王毅;王芳;叢中一;石毅;顏煒群;;完整人抗乙肝免疫球蛋白的表達(dá)制備[A];科技創(chuàng)新與節(jié)能減排——吉林省第五屆科學(xué)技術(shù)學(xué)術(shù)年會論文集（下冊）[C];2008年

6 王秋立;倪金鳳;申玉龍;;超嗜熱古菌Pyrococcus horikoshii β-D-內(nèi)切葡聚糖酶在畢氏酵母中的表達(dá)[A];中國資源生物技術(shù)與糖工程學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2005年

7 付泳航;李茹冰;佟明華;李繼東;孔祥平;;畢氏酵母表達(dá)的重組人可溶性TRAIL的發(fā)酵工藝[A];第十屆全軍檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2005年

8 江麗娜;趙瑞利;韓文瑜;雷連成;歐陽萍;;牛蛙抗菌肽在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及其活性檢測[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學(xué)術(shù)研討會論文集（下冊）[C];2009年

9 王虹;曾位森;陳金華;鄒耀東;劉丹;楊艷妮;;組織金屬蛋白抑制因子-1(TIMP-1)單克隆抗體的制備及ELISA檢測試劑盒的研制[A];第6次全國微生物學(xué)與免疫學(xué)大會論文摘要匯編[C];2004年

10 王萍;張銀波;胡小加;江木蘭;;橘林油脂酵母整合型表達(dá)載體的構(gòu)建及其產(chǎn)γ-亞麻酸的研究[A];中國微生物學(xué)會《第二屆全國農(nóng)業(yè)微生物研究及產(chǎn)業(yè)化研討會》和《第十一屆全國殺蟲微生物學(xué)術(shù)研討會》暨《湖北省暨武漢市微生物學(xué)會和內(nèi)蒙古微生物學(xué)會2008年會》論文摘要[C];2008年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 秦建成;恩度：誕生世界首例餓死腫瘤新藥[N];中國國門時報(bào);2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 沈麗琴;人可溶性4-1BB配體在畢氏酵母中的高效表達(dá)及其生物學(xué)功能的研究[D];蘇州大學(xué);2003年

2 時宏珍;人可溶性CD40配體在畢氏酵母中的高效表達(dá)及其生物學(xué)功能的研究[D];蘇州大學(xué);2001年

3 史訓(xùn)龍;重組表達(dá)過氧化氫酶及抗氧化損傷生物活性的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

4 朱劍昆;重組人白細(xì)胞介素-11的表達(dá)及其與多種細(xì)胞因子在小鼠急性放射損傷中的研究[D];蘇州大學(xué);2001年

5 賈林;畢氏酵母發(fā)酵過程建模和優(yōu)化[D];上海交通大學(xué);2007年

6 時紀(jì)元;人工合成SHH蛋白N末端基因的Pichia酵母表達(dá)及其多克隆抗體制備[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2007年

7 趙念璽;食管癌相關(guān)基因1（ECRG1）編碼蛋白質(zhì)的功能研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2004年

8 張冬梅;惡性瘧原蟲主要裂殖子表面蛋白1的表達(dá)及免疫保護(hù)作用的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2001年

9 張國廣;禽流感病毒M2重組多肽疫苗和DNA疫苗及其粘膜免疫研究[D];廈門大學(xué);2007年

10 李雅楠;芽孢桿菌β-甘露聚糖酶新基因的快速篩選、克隆及表達(dá)研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 劉蕾;人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7成熟肽的表達(dá)及其生物學(xué)活性的初步研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2007年

2 江陽;人重組白介素13在畢氏酵母中的表達(dá)及其體外誘導(dǎo)DC分化作用的研究[D];蘇州大學(xué);2001年

3 梁捷明;重組畢氏酵母發(fā)酵過程的代謝—氧傳遞組合模型[D];上海交通大學(xué);2007年

4 李樹玲;瘧原蟲裂殖子頂端膜抗原1（AMA-1）免疫保護(hù)功能域的分析[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

5 許y斏

本文編號：1570139