本文選題：海藻糖　切入點：免疫檢測　出處：《第一軍醫(yī)大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 海藻糖(trehalose)是一種由兩個葡萄糖分子以α，α，1，1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性二糖，廣泛存在于包括海洋生物海藻在內(nèi)的多種動植物與微生物體內(nèi)，，自身的化學(xué)及生物性質(zhì)非常穩(wěn)定。由于其能在高低溫、高滲透壓及失水等條件下在細胞表面形成獨特的保護膜，有效地保護蛋白質(zhì)等大分子的生物活性，被廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域作為活性物質(zhì)的保護劑。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的海藻糖溶液不僅可以有效減輕高低溫環(huán)境、時間以及固定劑、防腐劑對于細胞及其結(jié)合抗體活性的影響，而且可以在多種不同的免疫檢測體系中顯著提高信噪比，提高免疫檢測的效率。 一、海藻糖封閉液在不同免疫檢測體系中的應(yīng)用 我們首先選取了免疫檢測體系中應(yīng)用最為普遍的酶聯(lián)免疫吸附檢測(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)作為評價體系。實驗中，我們分別選擇了抗原包被直接法檢測抗體、抗原包被直接法檢測抗血清、抗原包被間接法檢測抗體、抗原包被間接法檢測抗血清以及雙抗體夾心法檢測抗原等不同的ELISA體系進行研究，同時選擇了5％脫脂奶粉封閉液、10％小牛血清、3％牛血清白蛋白(BSA)封閉液以及酪蛋白封閉液等常用封閉緩沖液作為對照檢驗不同濃度海藻糖封閉液對于檢測體系檢測敏感度與特異性的影響。結(jié)果表明，在各種不同的檢測體系，特別是糖結(jié)合抗原抗體反應(yīng)體系中，海藻糖封閉液均能夠在不影響檢測體系敏感度的前提下有效減少抗體的非特異性吸附，從而達到提高檢測體系信噪比的目的，滿足了檢測體系對于封閉液的要求，而在部分非特異性吸附較強的血清檢測體系、尤其是較為特殊的糖結(jié)合抗原抗體反應(yīng)體系中，海藻糖封閉液的封閉效果優(yōu)于5％脫脂奶粉封閉液等經(jīng)典封閉液，為實驗者提供了更好的選擇。此外，高滲的海藻糖溶液可以在不添加防腐劑的條件下保持較長時間的性狀，相對于傳統(tǒng)蛋白封閉液的抗菌要求無疑為實驗者提供了更大的便利。隨后，我們又使用蔗糖、果糖等其他二糖封閉液與海藻糖封閉液進行了比較，結(jié)果顯示，海藻糖封閉液的封閉效果明顯優(yōu)于果糖封閉液，而蔗糖封閉液基本不具備封閉效應(yīng)。 在海藻糖封閉液應(yīng)用于ELISA體系的實驗得到有效結(jié)果后，我們分別選擇了另外四種常用的免疫檢測體系檢驗海藻糖封閉液的適用范圍。 在斑點酶聯(lián)免疫吸附檢測(Dot-ELISA)與和Western Blot等以以PVDF膜為基質(zhì)的抗原抗體反應(yīng)體系體系中，海藻糖封閉液與其他傳統(tǒng)封閉液相比同樣表現(xiàn)出了優(yōu)異的封閉效果，表明海藻糖封閉液在不同固相基質(zhì)的抗原抗體反應(yīng)檢測體系中均能夠發(fā)揮明顯的封閉功效。 在得到了以上令人鼓舞的結(jié)果后，我們試圖將海藻糖封閉液應(yīng)用于細胞免疫組織化學(xué)檢測體系、細胞免疫熒光檢測體系以及流式細胞術(shù)中，實驗結(jié)果表明海藻糖同樣具良好的封閉效果，但與傳統(tǒng)封閉液比較未顯示其能夠有效增強以上免疫檢測體系信噪比的功能。盡管以上檢測體系中的封閉液應(yīng)用仍有爭議，但實驗結(jié)果也從另一方面展示了海藻糖封閉液寬廣的應(yīng)用前景。 綜合以上實驗結(jié)果以及海藻糖目前活性研究的進展，我們推測，海藻糖封閉液的作用機制可能基于其在固相基質(zhì)表面所形成的網(wǎng)絡(luò)化結(jié)構(gòu)，阻止蛋白的非特異性吸附，從而達到增強信噪比的功能，而不具備網(wǎng)絡(luò)化結(jié)構(gòu)的蔗糖與網(wǎng)絡(luò)化程度較弱的果糖則未能達到同樣理想的效果。而在以細胞為研究對象的檢測體系中，復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)化結(jié)構(gòu)則對海藻糖應(yīng)用的條件優(yōu)化提出了更高的要求。 二、海藻糖對于抗體及細胞活性的保護作用 已知，海藻糖可以通過在高低溫、高滲透壓及失水等條件下在細胞表面形成獨特的保護膜，有效地保護蛋白質(zhì)等大分子的生物活性。這提醒我們關(guān)注并探索海藻糖溶液能否對于免疫檢測體系中細胞以及抗原、抗體等大分子物質(zhì)的活性同樣具有保護效應(yīng)。 首先，我們以溫度與時間作為變量檢測不同濃度的海藻糖溶液對于高溫環(huán)境下蛋白的活性是否具有保護效應(yīng)，實驗表明，海藻糖溶液可在20天內(nèi)有效保護37℃以上、60℃以下高溫環(huán)境中預(yù)包被板抗原以及抗體的生物活性，極大滿足了生物分子運輸、儲存以及應(yīng)用的需要，驗證并豐富了文獻中關(guān)于海藻糖保護大分子物質(zhì)生物活性的論述。但是，在檢測海澡糖是否對于酶標(biāo)抗體的穩(wěn)定性也具有保護作用的實驗中，海藻糖卻并未能夠表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。同時，針對防腐劑的使用常常影響大分子活性而給日常應(yīng)用帶來諸多不便的情況，我們使用高滲的海藻糖溶液與傳統(tǒng)的疊氮納以及不影響生物活性的新型防腐劑Proclin300進行了比較，結(jié)果顯示，高滲的海藻糖溶液不僅可以防止污染，而且能夠有效保護抗體活性，同時在價格上具有絕對優(yōu)勢。 最后，我們結(jié)合以上實驗的結(jié)果以及文獻中對于海藻糖有效保護細胞穩(wěn)定性的論述，對海藻糖溶液在流式細胞術(shù)中的應(yīng)用進行了探討。針對流式細胞術(shù)檢測樣本制備與上機不同步的情況，對海藻糖溶液能否有效保護待檢樣本細胞以及抗體的活性與形態(tài)進行了探討。結(jié)果表明，海藻糖對于處理后樣本的保護性并不顯著，其應(yīng)用有待摸索。 綜上，我們不僅驗證了海藻糖溶液在異常溫度以及脫水干燥情況下對于細胞以及部分大分子物質(zhì)的活性保護效應(yīng)，而且為海藻糖溶液在抗體保護以及流式細胞術(shù)等免疫檢測體系中的應(yīng)用提供了新的思路。
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【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 唐磊,朱平,羅琛,徐湘民,富寧;抗人ζ珠蛋白鏈不同表位單克隆抗體的制備和鑒定[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2005年11期

2 許崇波,朱平,馬從林,石瑾琪,馮書章;抗A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體雜交瘤細胞系的建立及鑒定[J];細胞與分子免疫學(xué)雜志;1999年01期

本文編號：1567651