本文選題：梅毒螺旋體　切入點：重組抗原TpN17　出處：《西北大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 梅毒是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病之一，其病原體為梅毒螺旋體(Treponema pallidum，Tp)。血清梅毒抗體水平是診斷梅毒螺旋體感染的主要指標(biāo)，傳統(tǒng)方法包括性病實驗室研究試驗、熒光螺旋體吸收試驗和梅毒螺旋體血球凝集試驗等。近年來，以酶標(biāo)板為載體的梅毒螺旋體IgM和IgG抗體的檢測已被用于臨床檢驗和血站血液篩查。本研究工作包括兩個部分：1．梅毒螺旋體抗原TpN17在畢赤酵母中的表達(dá)與純化。2．以金磁微粒為載體，利用純化得到的TpN17抗原和市售梅毒螺旋體混合抗原(TpN15，TpN17，TpN47)建立針對梅毒螺旋體抗體的雙抗原夾心檢測方法。 通過甲醇誘導(dǎo)，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重組梅毒螺旋體抗原TpN17，樣品經(jīng)飽和硫酸銨沉淀粗提后，以陽離子層析交換柱對表達(dá)的TpN17進(jìn)行進(jìn)一步純化。結(jié)果表明，樣品經(jīng)硫酸銨沉淀、PB復(fù)溶后以陽離子交換層析柱進(jìn)行純化，NaCl濃度梯度洗脫，，可獲得純度大于90％的重組梅毒螺旋體抗原TpN17。Bradford法測定蛋白濃度為0.66 mg／mL。用過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記到抗原TpN17上，雙抗原夾心法測定HRP-TpN17滴度為1：3，200，作為包被的TpN17和標(biāo)記抗原HRP-TpN17可用于梅毒螺旋體抗體的檢測。 金磁微粒(Fe_3O_4／Au)是結(jié)合磁性氧化物粒子和膠體金特點的新型磁性復(fù)合微粒，組裝結(jié)構(gòu)的金磁微粒具有磁性Fe_3O_4核，表面組裝有大量納米級金粒子，集膠體金對生物分子的快速固定化和磁性納米粒子在外磁場可分離性于一體，在免疫學(xué)檢測領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。利用雙抗原夾心法原理，以純化得到的TpN17和標(biāo)記抗原HRP-TpN17，初步建立了基于金磁微粒的梅毒螺旋體抗體的檢測方法。金磁微粒表面形成夾心復(fù)合物后以3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺底物顯色，磁性分離后測定上清液在450nm處吸光度值。結(jié)果表明，在固定抗原量為480ng/管、HRP-標(biāo)記抗原稀釋度為1：1，600時，陽性血清的檢測值可達(dá)1.7以上，對已確診患者血清樣本的檢測表明，該方法的陽性檢出率為93.3％，還存在6.7％的漏檢率，說明方法的靈敏度和特異性還有待改進(jìn)。 為完善以金磁微粒為載體檢測梅毒抗體的方法，采用市售的重組梅毒螺旋體混合抗原(TpN47，TpN17，TpN15)對梅毒螺旋體抗體進(jìn)行檢測。將固定有混合抗原的金磁微粒與血清(或血漿)及HRP-標(biāo)記混合抗原在37℃溫育30 min后以3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺底物顯色，磁性分離后測定上清液在450 nm處吸光度值。對方法的臨界值、重復(fù)性、靈敏度、特異性等參數(shù)進(jìn)行確定。方陣滴定結(jié)果表明固定抗原量為420 ng／孔、HRP-標(biāo)記抗原稀釋度為1∶4，000為最佳反應(yīng)條件。本方法批內(nèi)變異系數(shù)(CV)值在5％以下，批間CV值為6.82％，符合免疫學(xué)載體的要求。該方法與以酶標(biāo)板為載體的商品化試劑盒檢測結(jié)果符合率為100％，靈敏度是商品化試劑盒的10倍。所建立基于金磁微粒的梅毒螺旋體抗體檢測方法具有潛在的應(yīng)用價值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

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