本文選題：Rbpj(CBF)　切入點(diǎn)：重組腺病毒　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》2014年05期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：目的:構(gòu)建并篩選特異性干擾Notch信號(hào)通路核轉(zhuǎn)錄因子Rbpj基因的重組腺病毒,探討通過(guò)Rbpj的經(jīng)典Notch信號(hào)通路在骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)9誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化中的作用。方法:設(shè)計(jì)3對(duì)針對(duì)小鼠Rbpj的siRNA序列,將其分別亞克隆至pSES-HUS穿梭質(zhì)粒,再與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183內(nèi)同源重組獲得重組質(zhì)粒,經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中包裝擴(kuò)增腺病毒,利用RT-PCR及Western blot進(jìn)行篩選、驗(yàn)證有效的干擾腺病毒。該重組腺病毒與AdBMP9處理MSCs細(xì)胞株C3H10T1/2,采用組織化學(xué)和RT-PCR檢測(cè)早期成骨指標(biāo)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和晚期成骨指標(biāo)骨橋蛋白(osteopontin,OPN),骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)及BMP下游靶基因Id 1、Runx 2等的表達(dá)。結(jié)果:成功構(gòu)建了3個(gè)重組腺病毒,并篩選出干擾效率最好的AdsiRbpj-2重組腺病毒,轉(zhuǎn)染C3H10T1/2,AdsiRbpj-2可以明顯下調(diào)BMP9誘導(dǎo)的早期成骨指標(biāo)ALP的活性及晚期成骨指標(biāo)OPN、OCN的表達(dá),成骨相關(guān)基因Runx 2等的表達(dá)也有下降。結(jié)論:成功構(gòu)建了特異性阻斷Notch經(jīng)典信號(hào)通路腺病毒載體AdsiRbpj-2,該重組腺病毒能夠抑制BMP9誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞的成骨分化進(jìn)程,從而進(jìn)一步證明Notch信號(hào)通路在BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化過(guò)程中有著重要的作用。
[Abstract]:Objective: to construct and screen recombinant adenovirus that specifically interferes with nuclear transcription factor Rbpj gene of Notch signaling pathway. To investigate the role of classical Notch signaling pathway of Rbpj in osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) induced by bone morphogenetic protein (BMP) 9. Methods: three pairs of siRNA sequences targeting mouse Rbpj were designed and subcloned into pSES-HUS shuttle plasmid. The recombinant plasmid was obtained by homologous recombination with skeleton plasmid pAdEasy-1 in Escherichia coli BJ5183. The recombinant plasmid was transfected into HEK293 cells by liposome. The adenovirus was amplified by RT-PCR and Western blot. The recombinant adenovirus treated with AdBMP9 and MSCs cell line C3H10T1 / 2 was used to detect the early osteogenic index, alkaline phosphatase (ALP), osteopontin (osteopontinin), osteocalcin (OCN) and downstream BMP by histochemistry and RT-PCR. Results: three recombinant adenoviruses were successfully constructed. The recombinant adenovirus of AdsiRbpj-2 with the best interference efficiency was screened. Transfection of C3H10T1 / 2 adsiRbpj-2 could significantly down-regulate the activity of ALP, an early osteogenic marker induced by BMP9, and the expression of OCN in late osteogenesis. Conclusion: adenovirus vector AdsiRbpj-2 was successfully constructed to specifically block the classical Notch signaling pathway. The recombinant adenovirus can inhibit the osteogenic differentiation of C3H10T1 / 2 cells induced by BMP9. It is further demonstrated that Notch signaling pathway plays an important role in the process of MSCs osteogenic differentiation induced by BMP9.
【作者單位】： 重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：重慶市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):CSTC2012jjA10004) 重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究資助項(xiàng)目(編號(hào):KJ130305)
【分類號(hào)】：R322.71

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