本文關(guān)鍵詞： 結(jié)核分枝桿菌 復(fù)活促進(jìn)因子 克隆 表達(dá) 純化　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的:構(gòu)建Mtb復(fù)活促進(jìn)因子B(RpfB)、D(RpfD)、E(RpfE)的原核表達(dá)質(zhì)粒,并在E.coli中表達(dá)和純化重組的Rpf樣蛋白,初步探討其對(duì)分枝桿菌生長的影響。 方法:以BCG基因組為模板,用PCR法擴(kuò)增出RpfB(1089bp)、RpfD(465bp)和RpfE片段(519bp),并分別連接在pET32a(+)載體上,重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和DNA測(cè)序鑒定后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)了RpfB、RpfD和RpfE蛋白;用免疫印跡法(Western-blot)鑒定重組蛋白后,采用Ni-NTA樹脂親和純化目的蛋白。然后將三種重組蛋白分別添加到LB培養(yǎng)基中,利用三種不同的方法(劃線法、涂布法、傾注法)接種MS,觀察不同的重組蛋白對(duì)細(xì)菌生長的影響。最后,以BCG、Mtb H37Ra、海分枝桿菌為研究對(duì)象,將三種重組蛋白分別添加到L-J培養(yǎng)基中,通過觀察菌落形成時(shí)間了解不同蛋白對(duì)細(xì)菌生長的影響 結(jié)果:重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定,片段大小與預(yù)計(jì)相符,測(cè)序結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析和Western-blot鑒定均發(fā)現(xiàn)分別在61kDa、39kDa、41kDa處有特異性條帶。用劃線法、涂布法、或傾注法均可觀察到LB培養(yǎng)基中到添加了任意一種重組蛋白都能加快MS的生長。將重組蛋白加入到L-J培養(yǎng)基中時(shí),添加蛋白組與對(duì)照組比較無顯著差異。 結(jié)論:成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-RpfB、pET32a(+)-RpfD、pET32a(+)-RpfE,并獲得了3種具有生物學(xué)活性的重組蛋白,能促進(jìn)MS的生長。未能觀察到添加了Rpf樣蛋白的L-J培養(yǎng)基有明顯的促遲緩生長型分枝桿菌(BCG、Mtb H37Ra、海分枝桿菌)生長的作用。
[Abstract]:Objective: to construct the prokaryotic expression plasmid of Mtb resurrection promoting factor (RpfB), and to express and purify the recombinant Rpf like protein in E.coli, and to explore its effect on the growth of Mycobacterium. Methods: using the BCG genome as a template, RpfBn1089bpPNV) and RpfE fragments were amplified by PCR and ligated into pET32a () vector respectively. The recombinant plasmid was digested and identified by DNA sequencing. The recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21 IPTG to induce the expression of RpfBU RpfD and RpfE protein. The recombinant protein was identified by Western blot and purified by Ni-NTA resin affinity. Then three recombinant proteins were added to LB medium respectively. The effects of different recombinant proteins on the growth of bacteria were observed. Finally, three recombinant proteins were added to L-J medium with BCGMtb H37Raand Mycobacterium seagrass as the research object. Effects of different proteins on bacterial growth by observing the time of colony formation. Results: the recombinant plasmid was identified by double enzyme digestion, the size of the recombinant plasmid was consistent with the expected size, and the sequencing results were consistent with those reported in the literature. The specific bands of the recombinant plasmid were found to be at 41 kDa by SDS-PAGE analysis and Western-blot analysis, respectively. It was observed that the growth of MS could be accelerated by adding any kind of recombinant protein from LB medium to L-J medium, but there was no significant difference between the added protein group and the control group when the recombinant protein was added to L-J medium. Conclusion: the recombinant expression plasmid pET32a (pET32a) was successfully constructed, and three kinds of recombinant proteins with biological activity were obtained. It was not observed that L-J medium supplemented with Rpf like protein could obviously promote the growth of Mycobacterium lactis.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R378.91

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本文編號(hào)：1550180