本文關鍵詞： Toll樣受體 單核巨噬細胞 SHP-1 熱休克 CpG ODN　出處：《浙江大學》2005年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)作為一種重要的模式識別受體,主要表達于巨噬細胞和樹突狀細胞表面。TLRs是Ⅰ型跨膜蛋白,屬于IL-1R/TLR受體超家族,通過辨認識別生物體內保守的病原相關分子模式(Pathogen-associated molecule patterns,PAMPs),活化巨噬細胞和樹突狀細胞,產生細胞因子和趨化因子,啟動天然免疫應答,構成機體免疫反應的第一道防線。Toll蛋白最早發(fā)現(xiàn)在調控果蠅的胚胎發(fā)育過程中起重要作用,目前,在哺乳動物細胞中相繼發(fā)現(xiàn)并克隆了11種TLR分子,選擇性識別病原體中特定的分子結構,以抵抗病原菌的入侵,TLR家族成員的缺失導致機體對病原體高度易感。本課題研究了單核巨噬細胞酪氨酸磷酸酶和熱休克對Toll樣受體信號轉導的調節(jié)以及相應的作用機制。 第一部分 SHP-1參與巨噬細胞TLR9信號轉導通路的研究 細菌DNA不僅是遺傳的物質基礎,其中某些特定序列還具有免疫活性。人工合成CpG寡核苷酸(CpG-Oligodeoxynucleotides,CpG ODN)能模擬細菌DNA的免疫活性效應。CpG ODN可活化自然殺傷細胞(Natural killer cell,NK細胞)、單核/巨噬細胞、樹突狀細胞、T細胞等,活化后的細胞可分泌IL-1、IL-6、TNFa等細胞因子、趨化因子、NO等免疫效應分子,誘導天然免疫應答。CpG ODN的辨認和信號傳導通過TLR9所介導。TLR9識別配體后,通過MyD88-IRAK-TRAF6激酶途徑募集接頭蛋白髓系分化蛋白88(MyD88),結合并活化IL-1受體相關激酶(IRAKs)、腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6),活化下游MAPKs和NF-κB誘導激酶(NIK)、IKK、IκBa,活化后的NF-κB入核引起特定基因的表達。 信號轉導過程中許多信號分子相互作用,使信號轉導保持一定的強度能順利傳導并能及時終止。SHP-1酪氨酸磷酸酶SHP-1(Src homology 2 domain containingphosphatase 1)最早也命名為SHPTP-1,SHP,HCP和PTP1C,是個胞內酪氨酸磷酸酶,主要表達于造血細胞。SHP-1含兩個N端SH2區(qū),單個磷酸酶區(qū),以及C端尾部的兩個酪氨酸磷酸化區(qū),是個淋巴細胞、巨噬細胞內常見的信號調節(jié)分子。本實驗 浙江大學博士學位論文 研究了在CpG ODN活化巨噬細胞TLRg誘導產生細胞因子等細胞免疫反應過程中, SHP一1參與的調節(jié)作用及其可能的作用機制。 我們構建了SHP一1高表達載體,PCR定點突變法構建SHP一1催化活性突變載體 (C4535),經測序鑒定正確。合成SHP一1 RNA干擾片段,轉染RAW264.7細胞以抑制 SHP一1蛋白合成。G418篩選穩(wěn)定表達SHP一1和催化活性突變mu一SHP一1 RAW細胞, 經CpG ODN刺激后,發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定高表達SHP一1的巨噬細胞的細胞因子IL6的分泌顯著 增加,而對于SHP一1催化活性突變的巨噬細胞,經CpG ODN刺激后其IL一6的分泌水 平依然升高,與高表達SHP一1巨噬細胞相比沒有明顯變化。而RNA干擾SHP一1蛋白 表達后,IL6的分泌水平下降。熒光素酶報告基因檢測顯示SHP一1高表達的巨噬細胞 經CpG ODN刺激后NF一忍的活化水平增高。這些實驗現(xiàn)象表明SHP一1高表達可能促 進CpG ODN刺激后NF一沼的活化,從而促進細胞因子IL一6的分泌。而催化活性的高 低與SHP一1促進細胞因子的表達關系不大。為進一步探討SHP一1促進CpG ODN刺激 巨噬后IL一6分泌的原因,檢測了MApK活化水平的改變。CpG ODN刺激后,發(fā)現(xiàn)SHP一1 高表達的巨噬細胞ERK、JNK的磷酸化水平沒有改變,而p38的磷酸化水平顯著增高, 說明sHP一1促進IL6的分泌可能部分與p38的磷酸化水平增高有關。免疫共沉淀進 一步檢測了cpG ODN刺激后與SHP一1在巨噬細胞內相互作用的一些信號分子,發(fā)現(xiàn) IKK、TRA王6與SHP一1形成蛋白復合物,顯示SHP一1可能通過與IKK、TRAF6結合活 化NF一慮,從而促進IL6的分泌。 上述實驗結果表明,SHP一1促進CpG ODN刺激巨噬細胞IL6的表達,其催化酶 活性的下降對IL6的表達沒有明顯影響,而RNA干擾后IL6的分泌水平下降,顯示 SHP一1的表達參與CpG ODN刺激后巨噬細胞p38、NF一慮的活化,而使IL一6的分泌增 高,表明SHP一1是個參與CPG ODN江LRg信號通路一個重要的胞內調控分子。本實驗 結果為深入認識cpG oDN月1,R9介導的信號轉導的調控提供了一個新的機制。 第二部分熱休克調節(jié)單核細胞Toll樣受體信號轉導研究 熱休克能通過誘導熱休克蛋白(Heat shock protein:3,HSPs)等應激蛋白誘導機體 的固有免疫應答。免疫反應中抗原遞呈細胞(Antigen一Presenting een,APC)通過調節(jié)病 原識別受體(pathogen reeo邵ition reeeptors,pRRs),識別病原相關的分子模式(RAMPs)
[Abstract]:Toll like receptors (Toll like receptors, TLRs) as a kind of important pattern recognition receptors expressed mainly in macrophages and dendritic cell surface.TLRs is a type I transmembrane protein, belongs to the IL-1R/TLR superfamily, by identifying the pathogenic organisms related to conserved recognition molecules (Pathogen-associated molecule patterns, PAMPs model), and activated macrophages dendritic cells, cytokines and chemokines, initiate innate immune response, the immune response constitutes the first line of defense.Toll protein was found to play an important role in the process, regulation of Drosophila embryonic development at present, have been found and cloned 11 TLR molecules in mammalian cells. The specific molecular structure of selective recognition of pathogens, to resist the invasion of pathogens, the lack of a member of the TLR family will cause the body to be highly susceptible to pathogens. The subject of mononuclear macrophage The regulation of phagocytic tyrosine phosphatase and heat shock to the signal transduction of Toll like receptor and the corresponding mechanism of action.
Part one SHP-1 participates in the study of TLR9 signal transduction pathway in macrophages
DNA is not only based on the genetic material of bacteria, which also has a certain sequence of immune activity of synthetic CpG oligonucleotides (CpG-Oligodeoxynucleotides, CpG ODN) to.CpG ODN immune effect simulation of bacterial DNA can activate natural killer cells (Natural killer cell, NK cells), monocytes / macrophages, dendritic cells, T cells and so on. The activated cells can secrete IL-1, IL-6, TNFa and other cytokines, chemokines, NO and other immune effector molecules induced by the innate immune response.CpG ODN recognition and signal transduction mediated by TLR9.TLR9 ligand recognition, through the MyD88-IRAK-TRAF6 adaptor protein kinase pathway to raise myeloid differentiation protein 88 (MyD88), combined with and the activation of IL-1 receptor associated kinase (IRAKs), tumor necrosis factor receptor associated factor 6 (TRAF6), activation of downstream MAPKs and NF- K B induced kinase (NIK), IKK, I K Ba activation of NF- kappa B nuclear special cause The expression of the fixed gene.
The interaction of many signal molecules in signal transduction, signal transduction to maintain a certain strength of the smooth transmission and timely termination of.SHP-1 tyrosine phosphatase SHP-1 (Src homology 2 domain containingphosphatase 1) was also named as SHPTP-1, SHP, HCP and PTP1C, is an intracellular tyrosine phosphatase, mainly expressed in hematopoietic cells containing.SHP-1 two N SH2, a single phosphatase domain two tyrosine phosphorylation and C tail, is a common signal molecular regulation of lymphocytes, macrophages in vitro.
Doctoral Dissertation of Zhejiang University
The immunoreaction of cytokines, such as cytokines, induced by CpG ODN activated macrophage TLRg, was studied.
The regulatory role of SHP 1 participation and its possible mechanism of action.
We constructed a SHP 1 high expression vector and PCR fixed-point mutation method for the construction of SHP 1 catalytic active mutation carrier
(C4535), correct by sequencing, synthesis of SHP 1 RNA interference fragments, transfection of RAW264.7 cells to inhibit
SHP 1 protein synthesis.G418 screening stable expression of SHP 1 1 and catalytic activity mutation mu SHP 1 RAW cells,
After CpG ODN stimulation, it was found that the secretion of cytokine IL6, which was stable and high expression of SHP 1 macrophages, was significant
Increase, and for macrophages with SHP 1 catalytic activity mutation, the IL 6 secreted water after the stimulation of CpG ODN
The level still increased, and there was no significant change compared with the high expression of SHP 1 1 macrophages. RNA interfered with SHP 1 protein.
After expression, the secretory level of IL6 decreased. The luciferase reporter gene detection showed the high expression of SHP 1 macrophages
The activation level of NF was increased after CpG ODN stimulation. These experimental phenomena suggest that the high expression of SHP 1 may be promoted.
The activation of NF marsh after the stimulation of CpG ODN stimulates the secretion of cytokine IL 1 6, and the catalytic activity is high
The relationship between low and SHP 1 promoting the expression of cytokines is not significant. To further explore the promotion of SHP 1 1 to promote CpG ODN stimulation
The cause of IL 6 secretion after Mega phagocytosis, detection of MApK activation level changes.CpG ODN stimulation, found SHP 1
The high expression of macrophage ERK, the level of phosphorylation of JNK did not change, and the level of phosphorylation of p38 was significantly higher.
This shows that the possible part of sHP 1 to promote the secretion of IL6 is related to the increased phosphorylation level of p38.
One step detected some of the signal molecules interacting with SHP 1 in macrophages after cpG ODN stimulation.
IKK, TRA King 6 and SHP - 1 forming protein complex, showing that SHP 1 1 may be combined with IKK, TRAF6
The consideration of NF, thus promoting the secretion of IL6.
The results of these experiments showed that SHP 1 promoted CpG ODN to stimulate the expression of IL6 in macrophage, and its catalytic enzyme
The decrease of activity had no significant effect on the expression of IL6, but the secretion level of IL6 decreased after RNA interference.
The expression of SHP 1 participates in the activation of p38, NF in macrophages after CpG ODN stimulation, and increases the secretion of IL 6.
High level, indicating that SHP 1 is an important intracellular regulator involved in the CPG ODN LRg signaling pathway.
The results provide a new mechanism for the in-depth understanding of cpG oDN 1, and the regulation of signal transduction mediated by R9.
Study on the signal transduction of Toll like receptor in the second part of heat shock regulating monocyte
Heat shock can induce the body by inducing stress proteins such as Heat shock protein:3 (HSPs) and other stress proteins
The intrinsic immune response. The antigen presenting cell (Antigen Presenting een, APC) in the immune response is mediated by the regulation of the disease
The original recognition receptor (pathogen reeo Shao ition reeeptors, pRRs), identifying the molecular pattern associated with the pathogen (RAMPs)

【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：R392.1

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本文編號：1550149