本文關(guān)鍵詞： 葡聚糖-精胺陽離子聚合物 轉(zhuǎn)染率 復(fù)合物 基因槍子彈　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 背景：基因治療是通過插入治療基因至病變細(xì)胞內(nèi)而產(chǎn)生特定功能的蛋白質(zhì)或抑制異�；虮磉_(dá)，從而治療疾病的一種新方法。基因治療中首要難題是缺乏高效、安全及靶向的基因?qū)胂到y(tǒng)，即能將治療基因輸送至特定的靶細(xì)胞內(nèi)并高效表達(dá)的、無毒或低毒的基因載體。目前基因載體的主要分為兩類：病毒載體或非病毒載體。雖然非病毒載體在體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染效率低于病毒載體，且基因表達(dá)時間短，但其具有低免疫原性、能攜帶大分子量DNA及生物安全性高等特點(diǎn)而倍受青睞。陽離子聚合物是非病毒載體中最有潛力的一類載體系統(tǒng)，它們可通過結(jié)構(gòu)修飾改變其物理化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)。 目的：合成水溶性葡聚糖-精胺陽離子聚合物基因載體DSP，研究以DSP為粘合劑基因槍子彈的制備方法、DSP／DNA復(fù)合物和基因槍子彈的生物物理學(xué)性質(zhì)、初步探討復(fù)合物的理化性質(zhì)對其轉(zhuǎn)染能力的影響。 方法：研究以平均分子量為40KDa的葡聚糖作為反應(yīng)起始物，在室溫下經(jīng)高碘酸鉀氧化6個小時，得到了氧化葡聚糖。通過鹽酸羥胺法測定了氧化葡聚糖醛基的含量，根據(jù)此含量將一定摩爾比的精胺與氧化葡聚糖反應(yīng)，該反應(yīng)能生成含希夫氏堿的葡聚糖-精胺亞胺聚合物，所得到的亞胺聚合物在過量硼氫化鈉作用下，可還原生成穩(wěn)定葡聚糖—精胺共價陽離子聚合物(DSP)。DSP的總含氮量及伯胺的含量分別通過元素分析儀及TNBS法測定，并計(jì)算了所合成DSP的接枝度及支化度；FT-IR及~1H-NMR鑒定了DSP化學(xué)結(jié)構(gòu)。采用激光粒度儀測定復(fù)合物溶液的粒徑和Zeta電位；瓊脂糖凝膠電泳法考察DSP與DNA的結(jié)合能力，及DSP對DNA在核酸酶Ⅰ作用下的保護(hù)能力；滴定法考察DSP的在酸性條件下的緩沖能力；復(fù)合物體外轉(zhuǎn)染SMMC-7721肝癌細(xì)胞及BHK-21細(xì)胞，通過熒光倒置倒置顯微鏡觀察復(fù)合物對兩株細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況并計(jì)算轉(zhuǎn)染率；MTT法考察復(fù)合物細(xì)胞毒性。在此基礎(chǔ)上，研究了以DSP為粘合劑制備的基因槍子彈，并通過瓊脂糖凝膠電泳、核酸酶降解試驗(yàn)和MTT法，分別研究了子彈的穩(wěn)定性，，抗核酸酶Ⅰ能力及細(xì)胞毒性。 結(jié)果：所合成氧化葡聚糖醛基含量為8.47±0.15 mmol／g，DSP接枝度為38.9％，支化度為38.5％。DSP能通過其帶正電荷的氨基基團(tuán)能與DNA帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)通過靜電吸附而將DNA完全壓縮并中和其負(fù)電荷，使DNA縮合形成復(fù)合物。復(fù)合物質(zhì)量比(DSP／DNA)在4∶1至20∶1之間，能形成穩(wěn)定的復(fù)合物；復(fù)合物粒徑范圍為162.6-187.9nm，Zeta電位則從+8.45mV增至+39.6mV；DSP能充分壓縮DNA并與之緊密吸附；DSP能有效保護(hù)DNA不受核酸酶Ⅰ降解，同時在一定pH范圍內(nèi)載體具有較強(qiáng)的緩沖能力；復(fù)合物在質(zhì)量比為8∶1時(此時粒徑為170.8±23.9nm，Zeta電位為+18.3±1.55mV)，對SMMC-7721肝癌細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率均達(dá)到最高，分別為27.0±4.42％及22.2±4.63％，其效果均與Lipofectamine 2000相當(dāng)；復(fù)合物的毒性隨質(zhì)粒濃度及DSP／DNA質(zhì)量比增加；所制備的基因槍子彈溶液在不同DSP／DNA．及DNA／金比例下均能粘合且能保護(hù)質(zhì)粒不受核酸酶降解；金含量越高，DSP／DNA比例越大，細(xì)胞毒性則越大。 結(jié)論：該研究表明DSP／DNA復(fù)合物的粒徑、電位、穩(wěn)定性、抗核酸酶能力、緩沖容量及細(xì)胞毒性對其轉(zhuǎn)染能力具有一定影響。所合成的葡聚糖-精胺陽離子聚合物是一種制備工藝簡單、高效、低毒的基因載體，有望今后用于臨床基因治療。以DSP制備的基因槍子彈抗核酸酶能力強(qiáng)，有望提高體內(nèi)基因槍轉(zhuǎn)染效率。
[Abstract]:Background: gene therapy is caused by the insertion of specific functional gene therapy to the lesion within the cell protein or inhibit abnormal gene expression, a new method to treat the disease. The primary problem in gene therapy is the lack of efficient gene delivery system to the safety and the target, which can be delivered to the target cells for gene therapy in particular and high expression of gene carrier, non-toxic or low toxicity. At present is mainly divided into two categories: gene viral vectors or non viral vectors. Although non viral vectors in vitro and in vivo gene transfection efficiency than viral vectors, and gene expression in a short time, but it has low immunogenicity, which can carry large molecular weight and DNA biological safety is high and popular. The cationic polymer is a kind of vector system has the most potential non viral vector, which can be changed by modification of the structure of its physical chemistry and biology. Quality.
Objective: to synthesize water-soluble dextran spermine cationic polymer gene carrier DSP, preparation methods of adhesive gene gun bullets with DSP, DSP / DNA complex biophysical properties and gene gun bullets, preliminary study of the effects of physicochemical properties of the complexes on the transfection efficiency.
Methods: To study the average molecular weight of 40KDa dextran as the starting reaction at room temperature by potassium periodate oxidation of 6 hours, the content of oxidized dextran. Oxidized dextran aldehyde was determined by hydroxylamine hydrochloride method, according to the content of the oxidized dextran spermine and reaction molar ratio, the reaction can be generated containing Schiff base dextran spermine imine polymer obtained, imine polymer in excess of sodium borohydride under the action of reducing the formation of stable covalent dextran spermine cationic polymer (DSP) content of total nitrogen and primary amine.DSP were determined by elemental analysis and TNBS, the grafting degree and support the degree of the synthesis of DSP and FT-IR calculation; and ~1H-NMR identification of DSP chemical structure determination of complex solution by laser particle size analyzer and the particle size and Zeta potential; agarose gel electrophoresis of DSP and DNA Combining ability, and DSP ability to protect DNA nuclease in 1 under the action of DSP was examined by titration; under the condition of acid buffering capacity; compound in vitro transfection of SMMC-7721 cells and BHK-21 cells, observe the complex on two cell transfection and transfection efficiency was calculated by inverted fluorescence microscope; MTT method effects of complex cell toxicity. On this basis, the research on DSP adhesive preparation of gene gun bullets, and by agarose gel electrophoresis, nuclease degradation test and MTT method, the stability of the bullet, nuclease resistant ability and cytotoxicity of 1.
Results: the content of synthetic oxidized dextran aldehyde is 8.47 + 0.15 mmol / g, the grafting degree of DSP is 38.9%, the phosphate group amino groups branching degree of 38.5%.DSP through its positively charged energy and negative charge with DNA through electrostatic adsorption and DNA completely compressed and neutralize the negative charge, the DNA condensation forming compound at complex mass ratio (DSP / DNA) between 4: 1 to 20: 1, complexes can form stable complexes; particle size in the range of 162.6-187.9nm, the Zeta potential is increased from +8.45mV to +39.6mV; DSP and DNA can be fully compressed tightly with adsorption; DSP can effectively protect DNA from nucleic acid I enzyme degradation, at the same time in a certain range of pH carrier has strong buffering capacity; complex in a mass ratio of 8: 1 (when the particle size is 170.8 + 23.9nm, the Zeta potential of +18.3 + 1.55mV), on SMMC-7721 hepatoma cells, the transfection rate of BHK-21 cells reached the highest point. Don't be 27 + 4.42% and 22.2 + 4.63%, and the results were equivalent to Lipofectamine 2000; the toxicity of compounds with plasmid concentration and DSP / DNA mass ratio increased; the solution preparation of gene gun bullets can adhesion and to protect DNA from nuclease degradation in different DSP / DNA. and DNA / Au ratios were; the higher the gold content and DSP / DNA ratio is greater, the greater the cytotoxicity.
Conclusion: the results showed that the DSP / DNA composite particle size, potential, stability, nuclease resistance, buffer capacity and cell toxicity has certain effect on the transfection ability. The synthesis of dextran spermine cationic polymer is a kind of simple preparation process, high efficiency, low toxicity gene carrier, is expected to in the future for clinical use gene therapy. DSP gene gun bullets prepared anti enzyme ability, is expected to improve the in vivo gene gun transfection efficiency.

【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R346

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本文編號：1492446