本文關(guān)鍵詞：hTFPI重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化　出處：《中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： hTFPI 重組蛋白 表達(dá)

【摘要】： 在多種疾病進(jìn)程中，包括癌癥、心腦血管疾病和炎癥等，由組織因子(tissue factor，TF)引發(fā)的外源性凝血系統(tǒng)的激活扮演重要角色，一些患者因此致死。組織因子途徑抑制因子(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)是抑制外源凝血的一種重要蛋白因子。大量臨床實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)證明，重組人組織因子途徑抑制因子(human recombinant tissue factor pathway inhibitor，rhTFPI)對血栓形成、感染性休克、血管再狹窄、內(nèi)毒素血癥和DIC等具有明顯防治作用，在臨床上有廣泛的應(yīng)用前景。 目前，，用多種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)rhTFPI的效果很不理想，存在的主要問題是表達(dá)量較低，以哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量最高(約2-5mg／L)，但成本也最高。我們應(yīng)用巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了rhTFPI的表達(dá)。通過優(yōu)化表達(dá)條件，使搖瓶培養(yǎng)下的rhTFPI的表達(dá)量達(dá)到了1.6mg／L；應(yīng)用發(fā)酵罐進(jìn)行高密度培養(yǎng)后，表達(dá)量比搖瓶培養(yǎng)方式提高了近2倍，達(dá)到了4.6mg／L。隨后，我們建立了相應(yīng)的純化方法，應(yīng)用了硫酸銨分級沉淀，陰離子交換層析和凝膠過濾層析，純化收率為43.1±0.38％，蛋白純度大于95％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用巴斯德畢赤酵母表達(dá)rhTFPI與其他表達(dá)系統(tǒng)相比具有以下優(yōu)勢：與哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比具有成本優(yōu)勢，無論是細(xì)胞培養(yǎng)成本和還是蛋白純化成本，前者都比后者明顯低廉；與大腸桿菌表達(dá)體系相比，具有表達(dá)量高，純化簡單，且重組蛋白翻譯后修飾更接近于天然的TFPI。
[Abstract]:In many disease processes, including cancer, cardio-cerebrovascular disease and inflammation, the activation of exogenous coagulation system induced by tissue factor-TFF plays an important role. Some patients died as a result. Tissue factor pathway inhibitor. Tissue factor pathway inhibitor. TFPI is an important protein factor to inhibit exogenous coagulation, which has been proved by a large number of clinical and animal experiments. Recombinant human recombinant tissue factor pathway inhibitor. RhTFPI has significant preventive and therapeutic effects on thrombosis, septic shock, vascular restenosis, endotoxemia and DIC. At present, the expression of rhTFPI by multiple expression systems is not satisfactory. The main problem is that the expression of rhTFPI is relatively low, and the expression of mammalian cells is the highest (about 2-5 mg / L). But the cost is also the highest. We used Pasteurus pastoris expression system for the expression of rhTFPI. Through the optimization of expression conditions. The expression of rhTFPI reached 1.6 mg / L in shaking flask culture. After high density culture in fermenter, the expression level was nearly 2 times higher than that in shaking flask culture, reaching 4.6 mg / L. Subsequently, we established the corresponding purification method and applied ammonium sulfate fractionation. The yield of anion exchange chromatography and gel filtration chromatography was 43.1 鹵0.38 and the purity of protein was higher than 95%. Using Pichia pastoris to express rhTFPI has the following advantages over other expression systems: it has a cost advantage over mammalian cell expression system. Both the cost of cell culture and the cost of protein purification were significantly lower in the former than in the latter. Compared with the Escherichia coli expression system, the recombinant protein has the advantages of high expression, simple purification, and post-translational modification of the recombinant protein is more similar to the natural TFPI.
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R341

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本文編號：1437954