本文關(guān)鍵詞：副粘病毒Tianjin株全基因組測序及生物信息學(xué)分析　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 副粘病毒為有包膜的負(fù)鏈RNA病毒，是一類重要的人類和動物致病病毒，如尼帕病毒(Nipah virus)、亨德拉病毒(Hendra virus)、Menangle病毒等。1999年我們從因呼吸道感染而死亡的靈長類動物狨猴肺組織中分離到一株病毒，經(jīng)過一系列研究初步證實(shí)該病毒可能是一株副粘病毒，暫時(shí)命名為副粘病毒Tianjin株。在病原鑒定過程中，我們曾經(jīng)通過RT-PCR方法擴(kuò)增得到該毒株一段長為375 bp的片段，并將測序結(jié)果發(fā)送到互聯(lián)網(wǎng)BLAST服務(wù)器進(jìn)行聯(lián)配檢索，發(fā)現(xiàn)其與仙臺病毒HN基因同源性較高，但推導(dǎo)出的氨基酸序列還存在較大差異。更重要的是，仙臺病毒是嚙齒類動物致死性病原體，然而在普通棉耳狨猴呼吸道疾病流行期間，飼養(yǎng)在同一實(shí)驗(yàn)中心的各種實(shí)驗(yàn)用鼠無一例發(fā)病。而且血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，動物中心工作人員都有此病毒的抗體；正常人群中對此病毒的抗體陽性率高達(dá)35％；患急性呼吸道感染的兒童抗體陽性率為19.28％，說明此病毒與人類關(guān)系密切，可能是仙臺病毒發(fā)生了某些變異而跨越了種屬界限，形成對嚙齒類動物低致病性，而對靈長類動物乃至人類高致病性的毒株；或者是一株未被發(fā)現(xiàn)的能引起靈長類動物及人類呼吸道感染的新的副粘病毒。為進(jìn)一步明確其來源和種系進(jìn)化地位，闡明與人類疾病間的關(guān)系，我們從分子水平上對該病毒進(jìn)行了較為深入的研究。 首先，在第一部分工作中，我們在引物步移測序策略指導(dǎo)下對副粘病毒Tianjin株全基因組進(jìn)行了測序。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的仙臺病毒全基因組序列，設(shè)計(jì)了13對引物，以雞胚尿囊液中提取出的病毒總RNA為模板，擴(kuò)增得到13個(gè)覆蓋整個(gè)基因組的相互重疊片斷，同時(shí)采用3’RACE和5’RACE法對Tianjin株基因組末端序列進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)克隆、測序、拼接，最后得到了Tianjin株的全基因組序列。結(jié)果表明，副粘病毒Tianjin株基因組由15，384個(gè)核苷酸組成，與已知仙臺病毒基因組長度完全相同，遵循“六堿基原則”。從基因組的3’端至5’端依次排列著3’UTR，結(jié)構(gòu)基因NP、P、M、F、HN和L編碼區(qū)，以及5’UTR。P基因內(nèi)同樣包含了另外一重疊的開放閱讀框，且存在著一個(gè)保守的RNA編輯位點(diǎn)(RNA editing site)3’-UUUUUCCC-5’。推測除了編碼NP、P、M、F、HN和L六種病毒特異性結(jié)構(gòu)蛋白外，另外還可能編碼C、V、W等非結(jié)構(gòu)蛋白。Tianjin株各結(jié)構(gòu)基因的上下游均存在著保守的基因起始信號S和終止信號E，連接E和S的是一個(gè)保守的三核苷酸間隔區(qū)GAA或GGG。但是與已知仙臺病毒相比，Tianjin株基因組結(jié)構(gòu)中有兩處明顯不同，一是在HN基因和L基因間保守的S序列中有一個(gè)堿基發(fā)生突變(A8532G)；二是L基因終止密碼子突變(A15240C)，導(dǎo)致預(yù)測的Tianjin株L蛋白比已知仙臺病毒L蛋白多了一個(gè)氨基酸。比較巧合的是，仙臺病毒BB1株也在該點(diǎn)出現(xiàn)同樣的突變。這些突變有可能導(dǎo)致Tianjin株出現(xiàn)一些獨(dú)特的生物學(xué)特性。 在本文第二部分工作中，我們對測序得到的Tianjin株全基因組序列進(jìn)行了較為全面的生物信息學(xué)分析。為了確定Tianjin株在副粘病毒科中的分類地位，我們將Tianjin株與副粘病毒科25株病毒全基因組序列進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，進(jìn)化樹顯示，Tianjin株與仙臺病毒、人副流感病毒1型、人副流感病毒3型和牛副流感病毒3型位于同一個(gè)分支，且與仙臺病毒親緣關(guān)系最接近，說明Tianjin株在分類上屬于副粘病毒科副粘病毒亞科呼吸道病毒屬。進(jìn)一步與GenBank中14株仙臺病毒全基因組序列比較，進(jìn)化樹顯示，Tianjin株不屬于現(xiàn)有的三個(gè)分支，而是獨(dú)立為一個(gè)分支，同源性分析同樣支持這一結(jié)果，因此Tianjin株應(yīng)被列為仙臺病毒第四種基因型。 另外，結(jié)構(gòu)基因推導(dǎo)出的氨基酸序列同源性比較顯示，P蛋白變異最大，雖然只有568 aa，卻含有29個(gè)獨(dú)特變異位點(diǎn)和35個(gè)與BB1共同具有的變異位點(diǎn)，與已知仙臺病毒同源性僅為78.7％～91.9％。比較其他仙臺病毒，也具有這樣的特點(diǎn)，說明P蛋白有可能是仙臺病毒的特異性抗原。六個(gè)蛋白中，同源性最高的是L蛋白，為96.0％～98.0％，其次是M蛋白，為93.1％～97.1％，說明二者較保守。氨基酸序列進(jìn)化樹分析顯示，六種結(jié)構(gòu)蛋白的進(jìn)化樹與基因組序列的進(jìn)化樹基本一致，僅有細(xì)微的不同，其中變化較大的是M蛋白。在M蛋白進(jìn)化樹中，，Tianjin株與Ohita株和Hamamatsu株代表的分支最接近，同源性也最高，為97.1％，與BB1株同源性為96.6％。而在其他蛋白進(jìn)化樹中，Tianjin株均與BB1株親緣關(guān)系最接近，同源性也最高。 基因組末端序列分析表明，Tianjin株3’和5’末端分別含有55 nt和57 nt的前導(dǎo)區(qū)，且高度保守，與已知仙臺病毒同源性分別為89.1％～98.2％和93.0％～96.5％。而且3’端最前12個(gè)核苷酸和5’端最后12個(gè)核苷酸互補(bǔ)配對，這些特點(diǎn)均與病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能密切相關(guān)。 除此以外，我們還分析了Tianjin株基因組序列中核苷酸變異位點(diǎn)的分布，以及預(yù)測的結(jié)構(gòu)蛋白中氨基酸變異位點(diǎn)的意義。Tianjin株基因組全序列中共存在444個(gè)獨(dú)特的和546個(gè)與BB1株共有的核苷酸變異位點(diǎn)，其中嘌呤-嘧啶之間的顛換突變分別占9.7％(43／444)和10.1％(55／546)。這些變異位點(diǎn)主要位于各個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)，從而導(dǎo)致Tianjin株結(jié)構(gòu)蛋白中存在著大量獨(dú)特的氨基酸變異位點(diǎn)。這些變異位點(diǎn)的存在提示Tianjin株有可能在生物學(xué)特性、致病性、免疫原性、流行病學(xué)等方面與其他仙臺病毒株具有很大的區(qū)別。關(guān)于這些變異位點(diǎn)與病毒生物學(xué)特性乃至致病性之間的關(guān)系，還有待將來采用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建重組病毒來證實(shí)。 綜上所述，本研究完成了副粘病毒Tianjin株基因組全長的序列測定，并且得到了可以長期保存的覆蓋病毒基因組全長的cDNA分段克隆，這些克隆為病毒基因功能研究提供了材料，同時(shí)也為構(gòu)建副粘病毒Tianjin株基因組全長cDNA克隆奠定了基礎(chǔ)。另外，我們通過生物信息學(xué)方法對Tianjin株的分類地位、與已知仙臺病毒的關(guān)系、以及各結(jié)構(gòu)蛋白中變異位點(diǎn)的意義進(jìn)行了探討，希望為以后進(jìn)一步深入研究該病毒的具體致病機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ)。
[Abstract]:In order to further clarify its source and species evolution status and to clarify the relationship between the virus and human diseases , we have carried out an in - depth study on this virus from molecular level . In the first part , we sequenced the whole genome of Tianjin strain by using 3 ' RACE and 5 ' RACE method . In order to determine the taxonomic status of Tianjin strain in Parviviridae family , we have carried out systematic evolution analysis of the whole genome sequence of 25 strains of parviviridae family . In order to determine the taxonomic status of Tianjin strain in Parviviridae family , we have shown that Tianjin strain belongs to the family parviviridae virus type 1 , human parainfluenza virus type 3 and bovine parainfluenza virus type 3 are located in the same branch , and the phylogenetic tree shows that the Tianjin strain belongs to the genus Parviviridae virus . In addition , the homology of amino acid sequence deduced from structural gene showed that P protein had the greatest variation . Although there were only 568 aa , there were 29 unique mutation sites and 35 mutation sites common to BB1 , and the homology was 96.1 % 锝

本文編號：1430178