本文關(guān)鍵詞：沙眼衣原體E血清型Ⅲ型分泌系統(tǒng)copN基因重組子建立表達(dá)和蛋白鑒定　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 衣原體(Chlamydia)是一類有獨(dú)特發(fā)育周期、嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物，具有以下特點(diǎn)：(1)革蘭氏陰性，圓形或橢圓形體：(2)具有DNA和RNA兩種類型的核酸：(3)衣原體以兩種形態(tài)存在。一種是小而致密的EB(elementary body，原體)，代謝不活躍，有感染性；另一種是大而疏松的RB(reticulate body，網(wǎng)狀體)，代謝活躍，能復(fù)制生長，無感染性。衣原體的感染從感染性的原體吸附到宿主細(xì)胞表面開始，隨后通過胞飲作用進(jìn)入上皮細(xì)胞，原體增大并分化為網(wǎng)狀體，網(wǎng)狀體以二分裂方式增殖，產(chǎn)生子代原體，感染細(xì)胞內(nèi)形成了含有網(wǎng)狀體和子代原體的空泡即包涵體。大量的原體隨著感染細(xì)胞的破裂涌出細(xì)胞外，再侵入新的細(xì)胞。(4)細(xì)胞壁成份中含有肽聚糖；(5)含有核蛋白體；(6)對多種抗生素都敏感。 衣原體廣泛寄生于包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物及鳥類。目前已知衣原體可分為四個(gè)種屬：沙衣眼原體(Chlamydia trachomatis, C. t)、肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體及家畜衣原體。C.t包括3個(gè)生物亞種：沙眼亞種、性病淋巴肉芽腫亞種、鼠亞種，前兩種引起人類疾患。C.t依據(jù)其主要外膜蛋白(major outer membrane protein，MOMP)抗原性的不同分為19個(gè)血清型，其中L1、L2、L2a和L3型引起性病淋巴肉芽腫(lymphogranuloma venereum, LGV)；A、B、Ba和C型引起沙眼，是全球致盲的首要原因；D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、K及基因變種Ja型引起泌尿生殖道感染，是目前國內(nèi)外最常見的性傳播疾病之一。肺炎衣原體感染不僅與呼吸系統(tǒng)感染有關(guān)，可導(dǎo)致衣原體肺炎、咽炎，而且與動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病的發(fā)病相關(guān)。因此，預(yù)防和控制衣原體感染已成為重要的公共衛(wèi)生問題。然而到目前為止衣原體的致病機(jī)理仍不完全清楚。Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type three secretion system，TTSS)是一種獨(dú)立的分泌蛋白的系統(tǒng)。很多革蘭氏陰性動(dòng)植物病原菌都將其產(chǎn)生的致病性蛋白通過TTSS送入動(dòng)、植物細(xì)胞胞質(zhì)。這些蛋白與真核細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)因子很相似，可以改變信號(hào)傳導(dǎo)的方向使宿主免疫反應(yīng)減弱，細(xì)胞骨架重組，建立適于寄生和發(fā)揮致病作用的亞細(xì)胞小環(huán)境。作為專性細(xì)胞內(nèi)寄生菌的衣原體也具有TTSS。從在上世紀(jì)70年代開始包括日本Matsumoto在內(nèi)的很多研究人員發(fā)表了衣原體表面的電鏡照片：一些凸起從衣原體外膜伸出，象“圓花飾”樣，而且在原體和網(wǎng)狀體表面均存在。而且這些凸起與其它細(xì)菌的Ⅲ型分泌結(jié)構(gòu)相似。在基因檢測中，首先在鸚鵡熱衣原體基因中發(fā)現(xiàn)了與Ⅲ型分泌系統(tǒng)基因同源的部分，Hsia在1997年首次提出了四個(gè)基因與Ⅲ型分泌結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因具有同源性。隨后，在有關(guān)衣原體基因組的工作中發(fā)現(xiàn)：衣原體基因組中的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因與其它具有Ⅲ型分泌系統(tǒng)的病原體編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)的基因有很高的同源性。而且，衣原體編碼的Inc(inclusion，包涵體)蛋白家族可以被異種Ⅲ型分泌結(jié)構(gòu)分泌。這些都為衣原體具有Ⅲ型分泌系統(tǒng)提供了依據(jù)。 基于目前對于其它細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的了解，人們建立了衣原體Ⅲ型分泌系統(tǒng)的模型。衣原體Ⅲ型分泌結(jié)構(gòu)是一個(gè)連續(xù)的橫跨衣原體內(nèi)膜和外膜的分泌孔道。CT089(CopN，Cop：Chlamydia outer protein衣原體外膜蛋白)是衣原體Ⅲ型分泌系統(tǒng)的重要組成部分，它是外在膜蛋白(外周膜蛋白)，象”蓋子”一樣起調(diào)節(jié)作用，當(dāng)無宿主感應(yīng)信號(hào)時(shí)阻止蛋白的分泌。Hackstadt等用CopN蛋白的特異性抗體進(jìn)行免疫印記分析，發(fā)現(xiàn)CopN蛋白不僅存在于原體、網(wǎng)狀體，而且在感染衣原體20小時(shí)后細(xì)胞培養(yǎng)的提取物中也檢測到CopN蛋白的存在。標(biāo)記CopN蛋白特異性抗體用直接免疫熒光分析衣原體感染20小時(shí)后的單層細(xì)胞顯示特異性的標(biāo)記呈小環(huán)狀附于衣原體包涵體的膜上，而且突出于表面�；谶@些觀察結(jié)果，說明CopN蛋白可以：①直接和衣原體相連；②結(jié)合于衣原體包涵體的膜；③可以被分泌。雖然人們對CopN蛋白的功能及如何作用知之甚少，但根據(jù)CopN蛋白與耶爾森菌的YopN分泌蛋白同源，CopN蛋白應(yīng)該象YopN蛋白一樣，在無宿主信號(hào)誘導(dǎo)時(shí)起調(diào)節(jié)作用阻止分泌。而一旦分泌被激活時(shí)，胞內(nèi)的分子伴侶CT088(Scc1)、cr576和CT862可以協(xié)助分泌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的底物。另外CopN蛋白可能通過宿主細(xì)胞接觸而激活，從而調(diào)節(jié)原核細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)為其形成早期的包涵體奠定基礎(chǔ)，并抑制宿主細(xì)胞調(diào)亡。 目的運(yùn)用分子生物學(xué)方法構(gòu)建copN-pTrcHisA重組子，E.coli BL21原核表達(dá)CopN蛋白，用聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western Blotting檢測CopN蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步研究CopN蛋白的功能和Ⅲ型分泌系統(tǒng)的作用機(jī)制，闡明衣原體的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。 方法 實(shí)驗(yàn)的大體流程如下： 1堿裂解法提取質(zhì)粒 (1)取-20℃保存的含有質(zhì)粒的E.coli DH5α解凍后吸取100μl菌液接種到LB瓊脂平板上(并加入相應(yīng)含耐藥基因的抗生素)，37℃溫箱中培養(yǎng)過夜。 (2)挑取單菌落接種到3ml LB液態(tài)培養(yǎng)基中(并加入相應(yīng)含耐藥基因的抗生素)，把培養(yǎng)試管放到水浴振蕩器中，37℃，100轉(zhuǎn)／分，振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。 (3)將1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用低溫離心機(jī)于4℃以12000g離心30秒，棄上清。 (4)加1 mlSTE，懸浮菌體，4℃以12000g離心30秒，棄上清。 (5)重復(fù)步驟(2)，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。 (6)將細(xì)菌沉淀重懸于100μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩。 (7)加200μl新配制的溶液Ⅱ。蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個(gè)內(nèi)表面均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上3分鐘。 (8)加150μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ。蓋緊管口，將管倒置后溫和振蕩10秒鐘使溶液Ⅲ在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，將管置于冰上3～5分鐘。 (9)用低溫離心機(jī)于4℃以12000g離心5分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。 (10)加等體積酚：氯仿(1：1)，振蕩混勻，用低溫離心機(jī)于4℃以12000g離心2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一新的離心管中。 (11)用2倍體積的乙醇沉淀雙鏈DNA，振蕩混合后于室溫放置2分鐘。 (12)用低溫離心機(jī)于4℃以12000g離心5分鐘。棄去上清液。 (13)用1ml70％乙醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀，棄凈上清，在空氣中使核酸沉淀干燥30分鐘。 (14)加50μl的用滅菌雙蒸水配置的RNA酶(20μg／ml)，以溶解已干燥的DNA沉淀。 (15)取5μl質(zhì)粒溶液，用1％瓊脂糖凝膠5v／cm電泳，約40分鐘，在紫外線透射反射分析儀下觀察結(jié)果。 2制備C.t的Copn基因： 2．1獲取C.t E型標(biāo)準(zhǔn)株的基因組DNA，作為PCR擴(kuò)增的模板。 (1)按如下成分配制裂解液：50mMKC1，2.5mM MgCl_2，10mM Tis-HCl(PH8.3)，0.1g／L明膠，0.45％NP-40，0.45％吐溫20，200mg／L蛋白酶K。 (2)取200μl細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)菌株液放入1.5ml Eppendorf管中，12000r／min，離心20min，棄上清。 (3)沉淀中加入50μl裂解液，振蕩混勻后，放入55℃水浴中1小時(shí)。 (4)加50μl Tris飽和酚，顛倒Eppendorf管，使內(nèi)容物混合成乳狀，蛋白質(zhì)變性。12000r／min，4℃離心5min，混合物分為兩相，上層是清澈透明的水相，下層是酚相。 (5)吸取水相至新的Eppendorf管，加入等體積的酚／氯仿(體積比1：1)，顛倒Eppendorf管數(shù)次，混勻內(nèi)容物。 (6) 12000r／min，4℃離心5min，吸取上層水相至新的Eppendorf管。 (7)加1／25體積的5M氯化鈉，混合均勻，再加2倍體積的冰冷無水乙醇，混勻后放置冰上20min，沉淀DNA。 (8) 12000r／min，4℃離心10min。 (9)倒棄乙醇，Eppendorf管倒置于干燥濾紙上，室溫蒸發(fā)痕量乙醇。 (10)加入20μl無菌雙蒸水，溶解DNA，—20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?另一種獲取基因組DNA的方法是只裂解不提純DNA，在步驟(3)后，沸水浴15min滅活蛋白酶K后離心3min，取含有DNA的上清液，做PCR擴(kuò)增的DNA模板，此方法省去DNA提純步驟，減少提純過程中的DNA損失。 2．2 PCR擴(kuò)增方法篩選C.t陽性臨床標(biāo)本： 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選擇C.t質(zhì)粒的特異性引物(上游引物KL1-5’TCCGGAGCGAGTTACGAAGA 3’；下游引物KL2-5’AATCAATGCCCGGGATTGGT 3’)，過程為滅菌雙蒸水→Buffer→dNTPmix→上游引物KL1→下游引物KL2→模板DNA→Taq DNA聚合酶的順序加樣，混勻后，短暫離心，加入30μl液體石蠟封閉反應(yīng)體系，以上操作均在冰盒中進(jìn)行，最后移入PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸60秒，共35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10分鐘，使反應(yīng)完全。用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果判定，但對于某些標(biāo)本效果不佳，所以選取不易判讀的標(biāo)本，采用8％的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行結(jié)果判定。 2．3 PCR擴(kuò)增C.t的CopN基因： 將篩選出的C.t陽性的標(biāo)本作為模板，用帶有限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的CopN基因特異性引物，以PCR的方法擴(kuò)增C.t的CopN基因，以獲得大量用于基因重組的目的基因。采用的引物是文獻(xiàn)中報(bào)道的C.t的CopN基因的特異性引物。這對引物根據(jù)Genebank中提供的C.t的L2血清型CopN基因序列設(shè)計(jì)，引物由上海博亞公司合成，序列如下： 上游引物1：5’-AAACCGCTCGAGGACTGCATCAGGAGGAGCTGGAGGG-3’其中劃線部分為限制性核酸內(nèi)切酶XhoI識(shí)別位點(diǎn)，AAACCG為保護(hù)性堿基，GAC與起始密碼子ATG相互補(bǔ)。 下游引物2：5’-TCCGGAATTCTTAGGGTGATGGAGG CTGTG TTGAGGTAGG-3’其中劃線部分為限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI識(shí)別位點(diǎn)，TCCG為保護(hù)性堿基。TTA與終止密碼子TAA相互補(bǔ)。 NO1、NO2引物擴(kuò)增的基因片段全長1288bp，其中包括CopN基因1266bp，兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)共12bp，保護(hù)性堿基共10bp。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性50秒，62／63℃退火50秒，72℃延伸80秒，35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10分鐘，使反應(yīng)完全。取5μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，判斷結(jié)果。 3重組子的建立 3．1載體質(zhì)粒pTrcHisA與CopN克隆基因的雙酶切和回收： 我們選擇XhoI和EcoRI做為限制性核酸內(nèi)切酶，兩種酶的識(shí)別序列及切割方式如下： 用限制性核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒的XhoI和EcoRI識(shí)別位點(diǎn)，使閉合環(huán)狀的雙鏈質(zhì)粒DNA分子打開呈線狀，并產(chǎn)生粘性末端。按照滅菌雙蒸水→10×NEBuffer→100×BSA→質(zhì)�！鶻hoI→EcoRl的加樣順序在冰中完成操作，吹打混勻，短暫離心5秒，移入預(yù)熱的恒溫水浴箱中，37℃水浴1小時(shí)。 用同樣的方法對CopN克隆基因進(jìn)行雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。分別回收質(zhì)粒和目的基因酶切后的產(chǎn)物，方法如下： (1)在紫外燈下切下有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎。計(jì)算凝膠質(zhì)量，該重量作為一個(gè)凝膠體積，如100mg=100μl體積。 (2)根據(jù)凝膠濃度，所用均為1％瓊脂糖凝膠應(yīng)加3個(gè)凝膠體積DE-A溶液�；旌暇鶆蚝笥�75℃加熱，間斷混合，直至凝膠完全熔化(約6-8分鐘)。 (3)加1.5個(gè)凝膠體積的DE-B溶液，混合均勻。 (4)吸取(3)中的混合溶液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管(置于2ml離心管)中，3600rpm，離心1分鐘。若液體殘留，加大離心轉(zhuǎn)數(shù)1分鐘。 (5)吸回濾液到DNA制備管中再吸附一次，3600rpm，離心1分鐘。 (6)將制備管置回離心管，加0.5mlW1溶液，3600rpm，離心30s，棄濾液。 (7)將制備管置回離心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm，離心30s，棄濾液。 (8)重復(fù)步驟(7) (9)將制備管置于離心管中，12000rpm離心1分鐘，凈棄W2溶液。 (10)將制備管置于潔凈的1.5ml離心管中，在DNA制備膜正中央加25μl水，室溫靜置1分鐘。12000rpm離心1分鐘洗脫DNA。 3．2連接和轉(zhuǎn)化 3．2．1 CopN基因與載體質(zhì)粒的連接 將酶切后回收的CopN基因與載體質(zhì)粒按接近10：1的分子比率混合，在T4 DNA連接酶作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，組建含CopN重組子。反應(yīng)條件為16℃16小時(shí)，再放入4℃冷藏24～48小時(shí)使反應(yīng)完全，反應(yīng)總體系為25μl，其中質(zhì)粒1μl，CopN基因19.5μl，10×L Buffer2.5μl，T4 DNA連接酶1μl(350u)，補(bǔ)足滅菌雙蒸水至25μl。 3．2．2氯化鈣法制備感受態(tài)E.coli DH5α (1)取-20℃保存的E.coli DH5α，接種于LB瓊脂平板，放置37℃溫箱中過夜培養(yǎng)。次日挑取單菌落接種到3ml LB液態(tài)培養(yǎng)基中，37℃，150rpm，搖菌過夜培養(yǎng)。 (2)取1ml菌液接種于14ml LB液態(tài)培養(yǎng)基中，37℃，150rpm，振蕩培養(yǎng)約2.5h，至OD260=0.6時(shí)，此時(shí)E.coli的濃度約為5×10~7／ml。將菌液平均倒入3個(gè)5ml Eppendorf管中，冰浴30min。4℃4000rpm離心10min收集菌體，棄凈上清。 (3)菌體懸浮于1ml冰預(yù)冷的100mmol／L CaCl_2中，冰上孵育10min，4℃，4000rpm離心10min收集菌體，棄凈上清。 (4)菌體重新懸浮于0.2ml冰預(yù)冷的100mmol／L CaCl_2中，混合均勻，4℃放置12～24h。 (5)向200μl感受態(tài)E.coli DH5α中加上述連接產(chǎn)物10μl(約40ng)，混勻，冰上孵育30min。此步驟設(shè)立兩個(gè)對照組：陽性對照，取10μl(約40ng)pTrcHisA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli；陰性對照，不加質(zhì)粒，代以10μl蒸餾水轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli。 (6)放置42℃水浴中，熱休克90s，再迅速置于冰上2min，然后每管加LB培養(yǎng)液800μl，37℃，培養(yǎng)1.5h。 (7)取200μl菌液均勻接種到含氨芐青霉素(100μg／ml)的LB固態(tài)培養(yǎng)皿上，倒置平皿，37℃，培養(yǎng)16h，觀察菌落生長情況，轉(zhuǎn)化成功的平皿于4℃保存。 3．2．3連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α 本實(shí)驗(yàn)借助熱休克將重組子導(dǎo)入處于感受態(tài)的E.coli DH5α。具體步驟如下： 向200μl感受態(tài)E.coli DH5α中加含CopN重組子10μl(約40ng)，混勻，冰上孵育30m。此步驟設(shè)立兩個(gè)對照組：陽性對照，取10μl(約40ng)載體質(zhì)粒(相應(yīng)未重組的質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli DH5α；陰性對照，不加質(zhì)粒，代以10μl滅菌雙蒸水轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli DH5α。 (1)放置42℃水浴中，熱休克90s。 (2)迅速置于冰上2m。 (3)每管加LB培養(yǎng)液800μl，37℃，培養(yǎng)1.5小時(shí)，使細(xì)菌復(fù)蘇，并表達(dá)重組質(zhì)粒編碼的Amp抗性標(biāo)記基因。 4陽性重組子的篩選和鑒定 4．1抗生素平板篩選法： E.coli DH5α本身無氨芐青霉素抗藥性，接種到含氨芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)板上后，不能存活。而pTrcHisA質(zhì)�；蛑泻邪逼S青霉素抗性基因，所以轉(zhuǎn)化有重組子CopN-pTrcHisA的E.coli DH5α仍具有氨芐青霉素抗藥性，能在含有氨芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)板上生長成單菌落。CopN-pTrcHisA重組子轉(zhuǎn)化E.coli DH5α后，用抗生素平板篩選法，可以篩選已轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒的E.coli DH5α。此外，pTrcHisA質(zhì)粒在E.coli中具有高拷貝擴(kuò)增的特性，隨著菌體的繁殖，可以獲得大量的重組子。除陽性重組子外，酶切不完全而自身環(huán)化的質(zhì)粒載體也能轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，生長成單菌落，形成假陽性，本法只是陽性重組子的初步篩選。CopN-pTrcHisA重組子轉(zhuǎn)化E.coli DH5α后，取200μl菌液接種于氨芐青霉素陽性的LB瓊脂平板上。陽性對照平板接種200μl已轉(zhuǎn)化pTrcHisA質(zhì)粒的E.coli DH5α。陰性對照平板接種的200μl菌液，為滅菌雙蒸水轉(zhuǎn)化的E.coli DH5α。接種后，37℃溫箱中培養(yǎng)16小時(shí)，觀察菌落生長情況。 4．2 PCR擴(kuò)增方法篩選陽性重組子 取數(shù)個(gè)LB瓊脂平板上的DH5α單菌落，培養(yǎng)E.coli DH5α，提取質(zhì)粒。以提取的質(zhì)粒為DNA模板，用引物NO1、NO2擴(kuò)增重組質(zhì)粒CopN-pTrcHisA中的CopN基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果鑒定。需要注意PCR反應(yīng)可能有假陽性存在，仍有必要作進(jìn)一步鑒定。 4．3重組子的酶切鑒定 重組子CopN-pTrcHisA基因序列全長約5.7Kb，其中含有pTrcHisA質(zhì)粒4.4Kb和CopN基因1266bp。提取的重組質(zhì)粒用XhoI和EcoRI限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切。酶切后1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。 4．4重組子的基因測序鑒定： 選取上述方法證明轉(zhuǎn)化成功的E.coli DH5α菌液800μl，送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行重組子基因的序列鑒定。 5測序正確的重組子轉(zhuǎn)化至蛋白表達(dá)菌E.coli BL21，方法同3．2．2。 6沙眼衣原體E型Bour菌株CopN的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取成功轉(zhuǎn)化CopN-pTrcHisA重組子的E.coli BL21單克隆菌落，加入到10ml液體帶有氨芐青霉素抗性(Amp 50μg／mL)的LB培養(yǎng)基中，37℃搖菌過夜。將該菌液加入1000mlLB液態(tài)培養(yǎng)基中(Amp 50μg／mL)，同上培養(yǎng)2h，至對數(shù)生長期。加入IPTG(終濃度0.03mM)，繼續(xù)搖菌2h。室溫10000轉(zhuǎn)／分，30秒離心收菌。得到5管濕菌沉淀，以冰浴TEN液洗滌2次(1／10體積洗滌)，加入溶菌酶(終濃度1mg／ml)、Triton-X 100(終濃度0.5％)冰上孵育15min。以49％振幅6秒12次超聲碎菌。懸濁液4℃12000rpm離心20分，分離沉淀和上清液分別儲(chǔ)存于—20℃冰箱以備分析。 7 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 (1)灌膠前，應(yīng)用洗衣粉或清潔液充分清洗灌膠玻璃板，并用無水乙醇沖洗貼膠面，最后用干凈的紗布拭干。操作時(shí)應(yīng)戴手套。安裝好灌膠裝置。 (2)選擇10％分離膠濃度。注意將膠充分混勻，TEMED先于AP加。灌好分離膠后，立即在其上加入蒸餾水封閉。靜置20min。 (3)配制4％積層膠。 (4)分離膠凝固后，傾出上層蒸餾水，可用濾紙吸干。倒入積層膠，插入梳子，注意不要產(chǎn)生氣泡。 (5)待凝膠聚合完全后，在電泳槽中加入電泳緩沖液(注意膠的下面不要存在緩沖液的氣泡)，小心移出梳子。用電泳緩沖液沖洗加樣孔。 (6)上樣：將獲得的樣品從-20℃冰箱中取出，于37℃溶化。用微量加樣器分別取15μl樣品溶液和5μl 4×SDS加樣緩沖液(終濃度為：0.0625mol／LTris-HCL、pH 6.8，2％SDS，10％甘油，5％2-巰基乙醇，0.001％溴酚藍(lán))加入0.2ml EP管中混勻。然后將含有蛋白和上樣緩沖液的EP管放入恒溫水浴鍋中，在100℃條件下煮沸3分鐘，使蛋白質(zhì)變性。煮沸結(jié)束后按預(yù)定順序加樣，每孔加樣品20ul。最后在所有不用的樣品孔中加上等體積的4×SDS凝膠上樣緩沖液。 (7)積層膠電壓穩(wěn)定在80V，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑越過積層膠與分離膠的分界線后，將電壓調(diào)整并穩(wěn)定在120V直至溴酚藍(lán)跑到膠底部(約1.5小時(shí))。 (8)切膠。上方切去濃縮膠部分，下方切去溴酚藍(lán)以下部分。 (9)考馬斯亮藍(lán)染色1h，脫色液洗3次，每次30min。 8．Western blot方法檢測CopN蛋白的表達(dá) (1) SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，方法同7。 (2)轉(zhuǎn)膜：根據(jù)凝膠大小剪取4張Whatman 3MM濾紙和1張硝酸纖維素，然后將濾紙、硝酸纖維素濾膜及凝膠于轉(zhuǎn)移緩沖液中處理10min。同時(shí)將海綿浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中。按如下方法安裝轉(zhuǎn)移裝置：陰極、一層海綿、兩層濾紙、膠、PVDF、膜、兩層濾紙、一層海綿、一層海綿，將氣泡趕凈(主要是膠和膜之間的氣泡)。 (3)將硝酸纖維素膜放入可熱密封的塑料袋，根據(jù)濾膜面積以0.1ml／cm~2的量加入封閉液，然后密閉袋口。平放在平緩搖動(dòng)的搖擺平臺(tái)上于室溫下孵育1～2小時(shí)。 (4)用封閉緩沖液按1∶800的比例稀釋his-tag單抗，并于振蕩器上混勻。 (5)剪開塑料袋，棄去封閉液，立即在裝有用上述方法處理過的硝酸纖維素濾膜的塑料袋中，，按每平方厘米0.1ml的量加入用封閉液稀釋的一抗，密封袋口，將濾膜平放在平緩搖動(dòng)的搖擺平臺(tái)上，于4℃孵育過夜。 (6)濾膜完成后，戴手套從塑料袋中取出膜，放在塑料盒中搖動(dòng)著用PBST洗3次，每次10～15min。 (7)用封閉液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG(二抗)，稀釋二抗?jié)舛戎?∶1000。 (8)將膜放進(jìn)一新的可密封塑料袋，按濾膜面積0.1ml／cm2加入用封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，在室溫下持續(xù)搖動(dòng)1～2h。 (9)戴手套從塑料袋中取出濾膜，放在塑料盒中搖動(dòng)著用PBST洗3次，每次10～15min。最后用PBS洗一次，時(shí)間為10～15min。 (10)將表面帶有抗原-抗體-抗抗體-HRP復(fù)合物的濾膜放在塑料盒中，加入配好的DAB顯色試劑(按說明書操作)，于平緩搖床上進(jìn)行顯色定位至條帶清晰為止，最后取出濾膜用蒸餾水洗2遍終止反應(yīng)。 (11)待印記膜在空氣中自然干燥后，將其密封入塑料袋中保存。 結(jié)果 1堿裂解法提取質(zhì)粒： 用1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約4400bp可見清晰的質(zhì)粒條帶，證明pTrcHisA質(zhì)粒提取成功。 2制備C.t的Copn基因： 2．2 PCR擴(kuò)增方法篩選C.t陽性臨床標(biāo)本： 1％瓊脂糖凝膠電泳和8％聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示，在241bp的位置發(fā)現(xiàn)了一條清晰的條帶，說明用衣原體質(zhì)粒引物KL1、KL2擴(kuò)增成功篩選C.t陽性的標(biāo)本，并為下一步擴(kuò)增CopN基因提供了模板DNA。在結(jié)果判定上，對于片斷較小PCR產(chǎn)物(如衣原體質(zhì)粒引物KL1、KL2擴(kuò)增產(chǎn)物僅241bp)，應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳效果更佳。 2．3 PER擴(kuò)增C.t的CopN基因： 用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果判定，在相當(dāng)于Marker1000—1500bp間出現(xiàn)清晰特異性條帶，引物N1、N2擴(kuò)增C.tCopN基因成功。 3重組子的建立 3．1載體質(zhì)粒pTrcHisA與CopN克隆基因的雙酶切和回收： 1％瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，與Marker相比較，酶切產(chǎn)物分別在4.4Kb(相當(dāng)于Marker 3500-5500bp間)和近1.3Kb(相當(dāng)于Marker1000-2000bp間)位置出現(xiàn)清晰特異性條帶，提示酶切成功。 3．2連接和轉(zhuǎn)化 重組子的抗生素瓊脂平板篩選結(jié)果顯示：陽性對照平板與實(shí)驗(yàn)平板都有菌落生長，且前者較后者菌落密集，陰性對照平板無菌落生長，提示重組子連接成功、轉(zhuǎn)化成功。 4陽性重組子的篩選和鑒定 4．1抗生素平板篩選法：結(jié)果同3．2．2 4．2 PCR擴(kuò)增方法篩選陽性重組子 1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，約1.3Kb處出現(xiàn)清晰特異的條帶，提示CopN基因與pTrcHisA質(zhì)粒連接成功，重組子CopN-pTrcHisA成功轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α。 4．3重組子的酶切鑒定 1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果顯示雙酶切后CopN-pTrcHisA重組子分隔成4.4Kb(相當(dāng)于Marker 3500-5500bp間)和近1.3Kb(相當(dāng)于Marker1000-2000bp間)大小兩個(gè)基因片段，證明CopN基因位于pTrcHisA質(zhì)粒內(nèi)，重組成功。 4．4重組子的基因測序鑒定： 測序結(jié)果與網(wǎng)上基因庫CopN基因相比完全一致，證明重組入質(zhì)粒的為CopN基因。 5測序正確的重組子轉(zhuǎn)化至蛋白表達(dá)菌E.coli BL21 重組子的抗生素瓊脂平板篩選結(jié)果顯示：陽性對照平板與實(shí)驗(yàn)平板都有密集的菌落生長，陰性對照平板無菌落生長，提示重組子轉(zhuǎn)化成功。 6沙眼衣原體E型Bour菌株CopN的誘導(dǎo)表達(dá) 聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果可見重組菌在48KD處有一濃集條帶，而空質(zhì)粒菌并無濃集條帶；Western blot結(jié)果也可見重組菌在約48KD附近有一條顯色條帶，而對照的空質(zhì)粒菌則沒有顯色條帶。兩者均證明CopN的誘導(dǎo)表達(dá)成功。 結(jié)論 1．成功構(gòu)建C.t E血清型的TTSS中CopN基因與pTrcHisA質(zhì)粒的重組體CopN-pTrcHisA。 2．本實(shí)驗(yàn)在構(gòu)建CopN重組子的過程中摸索出適合本實(shí)驗(yàn)室的分子生物學(xué)方法，獲得了經(jīng)驗(yàn)。 3．構(gòu)建C.t E血清型CopN基因重組子，為下一步表達(dá)CopN蛋白及其功能的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。 4．通過IPTG誘導(dǎo)得到了較多的CopN蛋白。 5．聚丙烯酰胺凝膠電泳和western blotting對蛋白進(jìn)行了鑒定。 CopN蛋白對Ⅲ型分泌系統(tǒng)的分泌蛋白起調(diào)節(jié)作用，對CopN蛋白的深入研究可能揭示Ⅲ型分泌系統(tǒng)的作用機(jī)制，闡明衣原體的致病機(jī)理。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R374

【引證文獻(xiàn)】

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1 王金星;陸承平;劉永杰;;嗜水氣單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)AopN蛋白原核表達(dá)及鑒定[J];畜牧與獸醫(yī);2013年07期

本文編號(hào)：1427579