本文關(guān)鍵詞：表皮葡萄球菌生物膜三維結(jié)構(gòu)、相關(guān)形成機(jī)制及組氨酸激酶YycG小分子抑制物的研究　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 凝固酶陰性的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)為人體皮膚表面常見的共生菌，通常不致病。但近年來隨著各種植入性醫(yī)療材料的廣泛使用，表皮葡萄球菌已成為院內(nèi)感染的主要條件致病菌，原因是其能在這些醫(yī)療材料表面形成生物膜(biofilm，BF)樣結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能夠更好的保護(hù)細(xì)菌抵抗抗生素的治療和人體免疫系統(tǒng)的攻擊，從而造成機(jī)體的反復(fù)感染，最終不得不將被污染的植入性醫(yī)療材料通過外科手術(shù)摘除，對患者造成極大的痛苦和對社會造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，由于抗生素的大量使用導(dǎo)致表皮葡萄球菌多重耐藥株(multi-drug resistant strains)的發(fā)生率日趨增高，急需開發(fā)新型的抗葡萄球菌感染的藥物，尤其是那些能有效地殺傷生物膜包被細(xì)菌的抗生素。因此，本課題的目的在于較深入的研究表皮葡萄球菌臨床株生物膜的動態(tài)形成過程，相關(guān)的分子機(jī)制并從中發(fā)現(xiàn)潛在的藥物靶標(biāo)，設(shè)計新型抗生物膜藥物。 目前缺乏觀察表皮葡萄球菌生物膜結(jié)構(gòu)的體外模型，96孔板結(jié)合結(jié)晶紫染色的方法雖然簡便，但只能進(jìn)行生物膜的定量分析，不能對生物膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及細(xì)菌的生理狀態(tài)進(jìn)行詳細(xì)的分析。Flow-chamber系統(tǒng)結(jié)合熒光染料染色和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)已被成功運(yùn)用于很多生物膜相關(guān)細(xì)菌的研究(如銅綠假單胞菌)，其優(yōu)點(diǎn)是能實(shí)時觀察生物膜的形成過程、內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化、各種成分分布及細(xì)菌的生理狀態(tài)等。然而，該系統(tǒng)應(yīng)用于表皮葡萄球菌生物膜的觀察尚未見報道，且不同細(xì)菌形成生物膜要求的培養(yǎng)條件也不同，因此尚需建立一個合適的培養(yǎng)條件來觀察表皮葡萄球菌生物膜的形成，并且這個培養(yǎng)條件應(yīng)該適用于大部分表皮葡萄球菌株(包括臨床分離株)。 已有的研究發(fā)現(xiàn)表皮葡萄球菌的生物膜形成分為兩個主要階段：單個細(xì)菌初始黏附到材料表面和細(xì)菌間的互相黏附形成多細(xì)胞層的結(jié)構(gòu)，并且已發(fā)現(xiàn)了參與這兩個階段的一些生物膜相關(guān)基因(如atlE、ica、aap等)。而作為表皮葡萄球菌生物膜主要成分的胞外多聚物質(zhì)(extracellular polymeric substance，EPS)，目前僅局限于細(xì)胞間多糖黏附素(Polysaccharide Intercellular Adhesion，PIA)的研究，它由ica操縱子編碼的蛋白合成，主要介導(dǎo)了細(xì)菌間的互相黏附，但對EPS其它成分如胞外DNA(extracellular DNA)在生物膜形成中的作用尚不得而知。 本論文在建立了flow-chamber和static-chamber觀察表皮葡萄球菌生物膜的體外培養(yǎng)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，對表皮葡萄球菌兩類主要的臨床分離株(ica~-／BF~+和ica~+／BF~+)的生物膜三維結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化及對抗生素處理的耐受性進(jìn)行了較全面的研究。對EPS的重要成分胞外DNA在表皮葡萄球菌生物膜形成過程中的作用及與胞外DNA釋放相關(guān)的分子機(jī)制進(jìn)行了較深入的研究。借助于蛋白結(jié)構(gòu)模建和高通量虛擬篩選技術(shù)，以表皮葡萄球菌組氨酸激酶YycG的保守功能域?yàn)榘袠?biāo)，尋找潛在的小分子抑制物并對其生物學(xué)活性進(jìn)行研究，在體外驗(yàn)證了其抗菌和抗生物膜活性，為開發(fā)新型的抗葡萄球菌感染的藥物奠定理論和實(shí)踐的基礎(chǔ)。 第一章表皮葡萄球菌生物膜三維結(jié)構(gòu)體外觀察模型的建立及臨床株生物膜結(jié)構(gòu)的研究 為更好的觀察表皮葡萄球菌形成生物膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)形態(tài)、成分分布及細(xì)菌狀態(tài)等，我們建立了flow-chamber和static-chamber觀察表皮葡萄球菌生物膜的體外培養(yǎng)系統(tǒng)。利用這些體外培養(yǎng)系統(tǒng)可以實(shí)時觀察表皮葡萄球菌生物膜的形成過程，經(jīng)各種不同熒光染料的染色后可以在激光共聚焦顯微鏡下清晰的觀察到生物膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)及內(nèi)部細(xì)菌的生理狀態(tài)。通過反復(fù)比較確定了適用于各系統(tǒng)的培養(yǎng)條件，為以后的研究制定了統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)。 利用上述兩種體外培養(yǎng)系統(tǒng)，我們首先觀察了兩株ica陰性生物膜陽性(ica~-／BF~+)的表皮葡萄球菌臨床株SE1和SE4的生物膜形成情況，并將其與ica陽性生物膜陽性(ica~+／BF~+)的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)株RP62A進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無論在flow-chamber系統(tǒng)還是在static-chamber系統(tǒng)中SE1和SE4均表現(xiàn)出與RP62A在生物膜形態(tài)上的明顯差異(甚至SE1和SE4之間也存在一定的差異)，且PIA特異性染色再次證明SE1和SE4形成的生物膜中不含有PIA。SE1和SE4形成的生物膜能抵抗NaIO_4處理，但能被Proteinase K處理所破壞；而RP62A形成的生物膜對NaIO_4和Proteinase K的反應(yīng)恰恰與之相反。雖然SE1和SE4形成的生物膜對萬古霉素處理具有一定的抗性，但這種抵抗能力不如RP62A形成的生物膜。此外SE1和SE4浮游狀態(tài)下生長的細(xì)菌與RP62A相比對溶葡萄球菌素和萬古霉素的耐受性更強(qiáng)，這與SE1和SE4菌株下降的自溶性有關(guān)。這些結(jié)果說明ica~-／BF~+臨床株代表了一類在抗生素選擇壓力下逐漸進(jìn)化的新亞型，但目前尚處于進(jìn)化的早期階段，其生物膜結(jié)構(gòu)及保護(hù)作用正在不斷完善中。 我們同時利用flow-chamber系統(tǒng)對4株ica~+／BF~+表皮葡萄球菌臨床株的生物膜形成進(jìn)行了一個長時程的觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些臨床株生物膜的一個顯著的特征是具有很強(qiáng)的“自我更新”能力，具體表現(xiàn)為培養(yǎng)1天左右均能形成完整的生物膜結(jié)構(gòu)且在微菌落(microcolony)的中心部分出現(xiàn)大量死細(xì)菌；培養(yǎng)2天左右這些部位的死細(xì)菌(也包括一小部分活細(xì)菌)從生物膜結(jié)構(gòu)中脫落，形成空泡狀結(jié)構(gòu)；培養(yǎng)3～4天左右在脫落的部位通過殘留細(xì)菌的分裂增殖又能夠形成新的生物膜，且其中基本上不含有死細(xì)菌；培養(yǎng)5～6天左右在微菌落的中心部分再度出現(xiàn)大量死細(xì)菌，開始新一輪的循環(huán)。而這種在生物膜結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的反復(fù)細(xì)菌死亡／脫落／再增殖現(xiàn)象與病人表現(xiàn)出的反復(fù)感染癥狀存在密切關(guān)聯(lián)。 第二章胞外DNA在表皮葡萄球菌生物膜形成中的作用 胞外DNA作為生物膜基質(zhì)的主要成分已被證明在很多細(xì)菌的生物膜形成中發(fā)揮著重要的作用，但其在表皮葡萄球菌生物膜中的存在及具體作用不得而知。DNA酶(DNaseⅠ)處理發(fā)現(xiàn)能抑制表皮葡萄球菌實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株生物膜的形成，但成熟的生物膜可以抵抗這種作用，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)DNaseⅠ可以明顯抑制表皮葡萄球菌的初始黏附(為表皮葡萄球菌形成生物膜的第一步)，這些結(jié)果均說明胞外DNA參與表皮葡萄球菌生物膜形成且與細(xì)菌的初始黏附密切相關(guān)。在分子水平實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胞外DNA的釋放與自溶素蛋白AtlE相關(guān)，因?yàn)閍tlE突變株胞外DNA的量、細(xì)菌初始黏附和生物膜形成能力與野生株相比均顯著下降(分別下降約90％，95％和97％)，而atlE突變回復(fù)株的這些能力又可以恢復(fù)到或接近野生株的水平。在flow-chamber和static-chamber系統(tǒng)中野生株和atlE突變回復(fù)株均能形成完整的生物膜結(jié)構(gòu)(很多微菌落microcolony)，而atlE突變株僅能形成一些很小的細(xì)菌團(tuán)塊其厚度遠(yuǎn)不如野生株的微菌落；DDAO染色表明在野生株和atlE突變回復(fù)株的生物膜結(jié)構(gòu)中存在大量的胞外DNA，而atlE突變株的細(xì)菌團(tuán)塊中只存在很少量的胞外DNA，并且這種胞外DNA釋放的明顯下降與atlE突變株形成細(xì)菌團(tuán)塊幾乎不含有死細(xì)菌密切相關(guān)，這是因?yàn)閍tlE突變株細(xì)菌的自溶性與野生株相比出現(xiàn)明顯降低(誘導(dǎo)4小時后野生株的自溶率達(dá)到95％，而atlE突變株的自溶率只有約30％)。目前表皮葡萄球菌生物膜中AtlE介導(dǎo)的胞外DNA釋放的調(diào)控機(jī)制尚不明確，但已有的結(jié)果說明胞外DNA同樣在以表皮葡萄球菌為代表的革蘭陽性細(xì)菌生物膜形成中發(fā)揮著重要的作用，雖然其釋放的分子機(jī)制與革蘭陰性菌如銅綠假單胞菌存在明顯的不同。 第三章表皮葡萄球菌組氨酸激酶YycG小分子抑制物的篩選及其活性的研究 細(xì)菌的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)廣泛存在于革蘭陽性和陰性細(xì)菌中，參與調(diào)控很多重要的生理功能，并且與很多病原菌的毒力和致病性密切相關(guān)，因而被認(rèn)為是潛在的藥物靶標(biāo)。我們運(yùn)用生物信息學(xué)分析在表皮葡萄球菌全基因組中共發(fā)現(xiàn)了16對雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，功能分析預(yù)測發(fā)現(xiàn)大部分雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)參與調(diào)控細(xì)菌離子交換、外蛋白分泌、黏附和自溶等重要的生理功能，其中有兩對雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)YycG／YycF和YhcS／YhcR調(diào)控細(xì)菌生長。以組氨酸激酶YycG的保守功能域HATPase_c為靶標(biāo)，模建該功能域的三維結(jié)構(gòu)并在此基礎(chǔ)上運(yùn)用高通量虛擬篩選技術(shù)共發(fā)現(xiàn)76個潛在的小分子抑制物(先導(dǎo)化合物)，生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明其中有7個化合物(compound 1—7)能明顯抑制表皮葡萄球菌的生長(MIC范圍在0.2～100μM)，它們中的5個(compound 1—5)還具有殺菌作用(MBC范圍在25～200μM)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)除了compound 6，其余6個化合物能在體外與靶標(biāo)蛋白YycG的片斷相互結(jié)合(結(jié)合平衡常數(shù)K_D范圍在2.3～40.4)，且能不同程度的抑制靶蛋白的磷酸化活性(半數(shù)抑制率濃度IC_(50)范圍在6.5～48μM)，證實(shí)這6個化合物為組氨酸激酶YycG的小分子抑制物。此外，這些小分子抑制物在工作濃度對哺乳動物細(xì)胞(Vero細(xì)胞)無明顯細(xì)胞毒性(MTT法)，也不引起健康人紅細(xì)胞的溶血，提示了這些化合物作為新型抗葡萄球菌感染藥物的開發(fā)前景。 利用static-chamber系統(tǒng)我們觀察了其中兩個YycG小分子抑制物(compound2和compound 5)在MBC濃度對表皮葡萄球菌生物膜中細(xì)菌的殺傷作用，并以萬古霉素作為對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明compound 2和compound 5對生物膜中的表皮葡萄球菌(包括實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株)具有很好的殺傷效果，但二者的作用有所不同，，compound 2對位于生物膜中微菌落底部的細(xì)菌具有較好的殺傷效果，而compound 5則對生物膜中的所有細(xì)菌均有明顯的殺傷作用。與之相比，臨床上常用于葡萄球菌耐藥株感染的萬古霉素不但對生物膜中的細(xì)菌無明顯殺傷作用且有輕微刺激生物膜形成的作用，這在表皮葡萄球菌臨床株上表現(xiàn)得更加明顯。對表皮葡萄球菌浮游細(xì)菌的time-killing assay也顯示compound 2和compound5具有比萬古霉素更快更有效的殺傷效率。
[Abstract]:In recent years , with the extensive use of various kinds of implantable medical materials , staphylococcus has become the main pathogenic bacteria of nosocomial infection because it can protect the bacteria against antibiotic therapy and the attack of human immune system , thus causing great suffering and great economic loss to the society . The present lack of an in vitro model for observing the structure of staphylococcus aureus biofilm , 96 well plate combined with crystal violet staining method is simple , but only quantitative analysis of biofilm can be carried out , and the internal structure of biological membrane and physiological state of bacteria can not be analyzed in detail . However , the system is applied to the research of biofilm related bacteria in real time ( such as pseudomonas aeruginosa ) . It has been found that the formation of biofilm formation is divided into two major phases : the initial adherence of a single bacterium to the surface of the material and the adhesion of bacteria to one another forms a multi - cell layer , and some biofilm - related genes involved in these two stages have been found ( e.g . atlE , ica , aap , etc . ) . The extracellular multimeric substance ( EPS ) , which is the main component of staphylococcus aureus biofilm , is currently limited to the research of intercellular polysaccharide adhesin , which is synthesized by the protein of ica operon , which mainly mediate the intercell adhesion , but the role of other components such as extracellular DNA ( extracellular DNA ) in the formation of biofilm is unknown . Based on the establishment of flow - chamber and static - chamber in vitro culture system , the dynamic changes of three - dimensional structure and the tolerance to antibiotic treatment were studied . The role of extracellular DNA in the formation of staphylococcus aureus biofilm and the molecular mechanism related to the release of extracellular DNA were studied . Establishment of three - dimensional structure in vitro and study on biofilm structure of clinical isolates In order to better observe the internal structure , composition distribution and bacterial status of biofilm , we established a flow - chamber and static - chamber to observe the biofilm formation process in vitro . The results showed that the biofilm formed by SE1 and SE4 could resist NaIO _ 4 treatment , but the biofilm formed by SE1 and SE4 could resist NaIO _ 4 treatment but could be destroyed by Proteinase K treatment . The biofilm formation of 4 strains of ica ~ + / BF ~ + S.aureus was observed by flow - chamber system . The results showed that there was a strong " self - renewal " ability in the central part of microcolony . Chapter II Role of extracellular DNA in the formation of staphylococcus aureus biofilm DNA enzyme ( DNase鈪

本文編號：1408188