本文關(guān)鍵詞：SARS病人組織中SARS冠狀病毒全基因組克隆、序列分析及病毒樣顆粒裝配　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2005年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：2003年春季在我國廣東、北京等地人群中爆發(fā)了以高熱、寒戰(zhàn)、肌肉痛、干咳、呼吸困難、高度接觸性傳染為主要特點(diǎn)的傳染性疾病，隨后該疾病被正式命名為“嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(簡稱SARS)”。病因?qū)W研究表明，SARS的病因是一種新型冠狀病毒，世界衛(wèi)生組織將其命名為SARS相關(guān)冠狀病毒(SARS-associated coronavirus，，SARS-CoV)。作為一種新發(fā)現(xiàn)的病毒，目前對其遺傳學(xué)和復(fù)制、裝配機(jī)制等還所知甚少，因此開展此方面研究具有重要意義。 筆者參與了SARS病原的調(diào)查工作。為深入闡明北京地區(qū)流行的SARA-CoV的病原學(xué)特征，首先從SARS病人病料標(biāo)本中進(jìn)行病毒分離試驗。將SARS病人臨床標(biāo)本，如咽拭子、痰液和肺組織標(biāo)本接種Vero細(xì)胞，連續(xù)傳代后，可觀察到顯著的細(xì)胞病理改變(CPE)，表明可能標(biāo)本中可能存在病毒。電鏡觀察分離物培養(yǎng)上清負(fù)染樣本，，可見到形態(tài)與典型冠狀病毒外觀相似的病毒樣顆粒；用SARS病人康復(fù)期血清進(jìn)行的間接免疫熒光試驗，顯示分離物接種培養(yǎng)的細(xì)胞胞漿內(nèi)存在特異性熒光，證實(shí)培養(yǎng)物中存在與SARS-CoV相關(guān)的病毒抗原；提取分離物總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測，可用冠狀病毒基因組序列特異性引物擴(kuò)增特異性片段，克隆擴(kuò)增片段后進(jìn)行DNA序列分析，結(jié)果顯示所擴(kuò)增的片段為冠狀病毒保守的復(fù)制酶基因區(qū)序列。因此綜合以上結(jié)果，提示分離到的病毒為SASR冠狀病毒 為比較來源于SARS病人人體組織和已經(jīng)分離、培養(yǎng)的SARS-CoV基因組之間的差異，闡明病毒的遺傳和變異特點(diǎn)并深入探討其致病機(jī)制，利用RT-PCR從北京地區(qū)一例SARS死亡病人(#5)肺組織總RNA中對SARS-CoV組織毒的基因組全長cDNA進(jìn)行了克隆和序列分析。參考已經(jīng)發(fā)表的SARS-CoV全序列，將待測定的SARS-CoV全長基因組分成26個片段，設(shè)計引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增并克隆的26個目的片段覆蓋SARS-CoV全長基因組。測序結(jié)果表明本次實(shí)驗中SARS-CoV-5#毒株基因組全長29707個核苷酸。同源性比對結(jié)果表明，SARS-CoV組織毒5#基因組序列與BJ01-BJ04地方分離株為同一流行株型。本次試驗測定的組織毒的基因組序列在基因組水平上與18株全序列已知人源毒株的堿基差異不明顯，而與10株動物來源的SARS-CoV分離株全序列在92個核酸位點(diǎn)上存在明顯差異，這說明人源SARS-CoV毒株的全序列與動物源SARS-CoV毒株的全序列存在基因組水平的堿基差異，而細(xì)胞培養(yǎng)和人體組織來源的SARS毒株不存在基因組水平的堿基差異。對各種來源的SARS病毒的S蛋白質(zhì)基因分析同樣也顯示了類似的堿基差異
[Abstract]:In 2003 in Guangdong, Beijing and other places in China, outbreaks of infectious diseases were characterized by high fever, shivering, muscle pain, dry cough, dyspnea, and highly contagious infections. The disease was later officially named "severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)". Etiological studies have shown that SARS is a new type of coronavirus. The World Health Organization named it SARS associated coronavirus SARS-associated coronavirus. As a newly discovered virus, SARS-CoV has little knowledge of its genetics, replication and assembly mechanism, so it is of great significance to study this aspect. In order to elucidate the etiological characteristics of SARA-CoV epidemic in Beijing, the authors participated in the investigation of the pathogen of SARS. Firstly, virus isolation test was carried out from the samples of SARS patients. The clinical specimens of SARS patients, such as pharyngeal swabs, sputum and lung tissues, were inoculated with Vero cells and then passed on continuously. Significant cytopathological changes were observed, indicating the possible presence of viruses in the specimens. The negative staining samples of the culture supernatants of the isolates were observed by electron microscopy. The appearance of virus like particles was similar to that of typical coronavirus. The indirect immunofluorescence test in the convalescent serum of SARS patients showed that specific fluorescence existed in the cytoplasm of the cells inoculated with the isolate. It was confirmed that there were virus antigens related to SARS-CoV in the culture. Total RNA was extracted for RT-PCR detection. Specific fragments of coronavirus genome sequence were amplified by specific primers, and then amplified by DNA sequence analysis. The results showed that the amplified fragment was conserved by the sequence of the replicase gene of coronavirus. Therefore, the above results suggest that the isolated virus is SASR coronavirus. In order to compare the differences between the human tissues from SARS patients and the isolated and cultured SARS-CoV genomes, the genetic and variation characteristics of the virus were elucidated and the pathogenetic mechanism of the virus was discussed. #5, a case of SARS death in Beijing using RT-PCR. The genomic full-length cDNA of SARS-CoV tissue virus was cloned and sequenced from the total RNA of lung tissue. Reference was made to the published full SARS-CoV sequence. The full-length SARS-CoV genome was divided into 26 fragments. The primers were designed to amplify. The 26 target fragments were amplified and cloned to cover the full-length SARS-CoV genome. The sequencing results showed that the total length of the genome of the SARS-CoV-5# strain in this experiment was 297. The homology analysis of 07 nucleotides showed that. The genomic sequence of SARS-CoV tissue virus is the same as that of the local isolate of BJ01-BJ04. The genomic sequence of the tissue virus determined in this experiment is totally sequenced with 18 strains at the genomic level. There was no significant difference in the bases of known human strains. However, there were significant differences in 92 nucleic acid loci between the whole sequence of SARS-CoV isolates and 10 animal isolates. This indicated that there was a genomic difference between the whole sequence of human SARS-CoV strain and that of animal SARS-CoV strain. However, SARS strains derived from cell culture and human tissues did not have genome-level differences. The S-protein gene analysis of SARS viruses from various sources also showed similar base differences.
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R511.9;R373

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6 李玉花 王淑君;SARS冠狀病毒全基因組基因克隆成功[N];健康報;2003年

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本文編號：1406299