本文關鍵詞：LY3磷酸酶基因的原核表達及其單克隆抗體的初步制備　出處：《安徽醫(yī)科大學》2007年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： LY3基因 磷酸酶 原核表達 單克隆抗體

【摘要】： 目的:在擴增、克隆人的LY3基因的基礎上,構建相應的重組原核表達載體,原核表達含LY3的融合蛋白,并以此為免疫原,應用雜交瘤單克隆抗體技術制備LY3單克隆抗體,為將來進一步研究該基因的功能奠定基礎。方法:根據(jù)LY3蛋白編碼基因的序列,設計引物,PCR擴增LY3基因,通過限制性內切酶酶切、連接等亞克隆技術,利用pET-28a(+)質粒構建含LY3基因的原核表達載體,酶切、測序等鑒定,轉化大腸桿菌后加IPTG誘導融合蛋白表達,SDS-PAGE分離表達的LY3蛋白,經Ni2+-NTA凝膠親和層析純化目的蛋白,用Western Blot方法檢測重組蛋白的表達。以SDS-PAGE分離得到的融合蛋白為抗原,免疫Balb/c小鼠,利用B淋巴細胞雜交瘤技術制備單克隆抗體,并通過間接ELISA方法鑒定。結果:成功構建了含LY3基因的重組原核表達質粒pET-28a(+)-LY3,轉化大腸桿菌經IPTG誘導后,Western Blot檢測到LY3融合蛋白的表達。以SDS-PAGE分離得到的融合蛋白為抗原免疫Balb/c小鼠,間接ELISA方法鑒定結果表明得到穩(wěn)定的單克隆抗體。結論:成功構建出LY3原核表達載體并在原核細胞中表達成包涵體,以此作抗原免疫小鼠,成功制備出LY3單克隆抗體。為進一步研究LY3的生物學功能奠定基礎。
[Abstract]:Objective: to construct the recombinant prokaryotic expression vector based on the amplification and cloning of human LY3 gene, and to express the fusion protein containing LY3 in prokaryotic expression. LY3 monoclonal antibody was prepared by hybridoma monoclonal antibody technique, which laid a foundation for further study of the function of the gene. Methods: according to the sequence of LY3 protein coding gene, primers were designed. The LY3 gene was amplified by PCR and subcloned by restriction endonuclease digestion and ligation. The prokaryotic expression vector containing LY3 gene was constructed by using pET-28a () plasmid. The expression vector was identified by restriction endonuclease digestion and sequencing. The fusion protein was isolated and expressed by SDS-PAGE and then purified by Ni2-NTA gel affinity chromatography. The expression of recombinant protein was detected by Western Blot. The fusion protein isolated by SDS-PAGE was used as antigen to immunize Balb/c mice. Monoclonal antibodies were prepared by B lymphocyte hybridoma technique. Results: the recombinant prokaryotic expression plasmid pET-28a (pET-28a- LY3) containing LY3 gene was successfully constructed and transformed into Escherichia coli induced by IPTG. The expression of LY3 fusion protein was detected by Western Blot. The fusion protein isolated from SDS-PAGE was used as antigen to immunize Balb/c mice. Conclusion: the prokaryotic expression vector of LY3 was successfully constructed and expressed as inclusion body in prokaryotic cells, which was used as antigen to immunize mice. LY3 monoclonal antibody was successfully prepared, which laid a foundation for further study on the biological function of LY3.
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392

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