本文關(guān)鍵詞：M電流調(diào)節(jié)與大鼠SCG神經(jīng)元興奮性的關(guān)系　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】： 交感神經(jīng)系統(tǒng)在調(diào)節(jié)生理過(guò)程的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用,其與靶組織的相互作用決定了交感神經(jīng)元的形態(tài)和電生理特性。哺乳動(dòng)物的外周交感神經(jīng)系統(tǒng)在解剖學(xué)上可以分為兩類(lèi):椎前交感神經(jīng)節(jié)與椎旁交感神經(jīng)節(jié)。兩類(lèi)神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元的起源相同,但在發(fā)育的過(guò)程中不同神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元在功能和性質(zhì)上存在明顯的差異。椎前神經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)元同時(shí)接受來(lái)自外周和中樞的突觸傳入,作為一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的整合中心控制交感神經(jīng)向胃腸道的脈管和腸神經(jīng)系統(tǒng)輸出信號(hào)。相反,大多數(shù)椎旁神經(jīng)節(jié)雖然有一定數(shù)量的節(jié)前傳入會(huì)聚,但其只是單純的從脊髓向靶器官傳遞信息,并不能整合其它來(lái)源的信息。大鼠頸上交感神經(jīng)節(jié)(superior cervical ganglia,SCG)是體積較大的融合神經(jīng)節(jié),位于椎旁神經(jīng)鏈的頭側(cè),其靶組織包括頭部和頸部的脈管系統(tǒng)、頜下腺及虹膜。 在不同哺乳動(dòng)物的交感神經(jīng)元中,普遍證實(shí)存在兩種不同電生理類(lèi)型的神經(jīng)元,一種稱(chēng)為phasic神經(jīng)元,另一種稱(chēng)為tonic神經(jīng)元。Phasic神經(jīng)元接受來(lái)自脊髓節(jié)前運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)出的少數(shù)較大的閾上刺激,主要作為延遲神經(jīng)元連接中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周的器官;相反tonic神經(jīng)元接受來(lái)自節(jié)前的脊髓神經(jīng)元和外周感覺(jué)神經(jīng)元發(fā)出的多數(shù)較小的閾下刺激,并整合刺激使細(xì)胞發(fā)放動(dòng)作電位。在持續(xù)的去極化刺激條件下,phasic神經(jīng)元與tonic神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放形式不同,前者只有動(dòng)作電位的短暫瞬時(shí)爆發(fā),而后者則表現(xiàn)為動(dòng)作電位的連續(xù)發(fā)放。 交感神經(jīng)元發(fā)放特性的不同與其表達(dá)的電壓門(mén)控型離子通道的種類(lèi)和特性有關(guān)。多個(gè)研究小組的結(jié)果提示,交感神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放特性可能與“A電流”、“M電流”或“D2電流”有關(guān)。目前認(rèn)為與“M電流”的關(guān)系最為密切。M電流是一種低閾值、電壓和時(shí)間依賴型、慢激活、慢去活、非失活的外向鉀電流。它由Brown和Adams于1980年首次在牛蛙的交感神經(jīng)節(jié)中發(fā)現(xiàn)。介導(dǎo)M電流的通道稱(chēng)為M通道。M通道廣泛分布于眾多類(lèi)型的組織和細(xì)胞中,其中包括交感神經(jīng)節(jié)、背根神經(jīng)節(jié)、海馬組織、一些中樞神經(jīng)細(xì)胞、NG108-15和PC12細(xì)胞系,等等。M通道是KCNQ基因編碼的鉀離子通道超家族中的一員,目前認(rèn)為KCNQ2/KCNQ3異聚體是神經(jīng)M通道的主要分子基礎(chǔ),KCNQ5亞單位與M通道構(gòu)成的多樣性有關(guān)。M通道基因改變或功能障礙與癲癇、良性家族性新生兒驚厥癥(BFNCs)、阿爾茨海默氏病(Alzheimer’Disease)、疼痛等神經(jīng)系統(tǒng)病變有關(guān)。 M電流是唯一在閾電位附近激活的電流,它與可興奮細(xì)胞的興奮性密切相關(guān)。M電流在神經(jīng)元向閾電位方向去極化時(shí)被緩慢激活,使細(xì)胞膜電位超極化,減少去極化,起到穩(wěn)定細(xì)胞膜靜息電位的作用。當(dāng)M電流受到抑制后,細(xì)胞膜易發(fā)生去極化,使細(xì)胞容易爆發(fā)動(dòng)作電位,進(jìn)而改變細(xì)胞動(dòng)作電位的發(fā)放性質(zhì)和對(duì)突觸傳入的反應(yīng)性。M電流可接受眾多神經(jīng)遞質(zhì)與激素的調(diào)節(jié),包括:乙酰膽堿(Acetylcholine)、緩激肽(Bradykinin)、血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ)、黃體生成素釋放激素(LHRH)等。它們通過(guò)激活相應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)的受體(GPCR)或通過(guò)影響其下游的信號(hào)分子(PIP2、IP3、DAG、PKC等)調(diào)節(jié)M電流,進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)興奮性的作用。 除GPCR外,其他種類(lèi)的受體如受體酪氨酸蛋白激酶(RTKs)類(lèi)等對(duì)M通道的作用研究很少。 神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophin,NT)家族中最早發(fā)現(xiàn)的成員。除神經(jīng)生長(zhǎng)因子外,本家族還包括腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain- derived Neurotrophic Factor, BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(NT- 3)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子4/5(NT-4/5)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子6(NT-6)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子7(NT-7)等。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中并通過(guò)相應(yīng)受體來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活、增殖、分化,神經(jīng)突起的生長(zhǎng)及重要的功能蛋白質(zhì)如受體蛋白、離子通道蛋白等的表達(dá);除此之外,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子還能調(diào)節(jié)神經(jīng)元之間突觸的形成和傳遞,神經(jīng)遞質(zhì)的釋放以及長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用等。 神經(jīng)生長(zhǎng)因子的受體有兩種:一是原肌凝蛋白相關(guān)受體A(Tropomyosin related kinase A, Trk A),屬于受體酪氨酸蛋白激酶家族;一是泛神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體p75NTR,即神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員的共同受體,屬于腫瘤壞死因子家族受體。 兩分子神經(jīng)生長(zhǎng)因子結(jié)合于Trk A受體,可引起受體二聚化、自我酪氨酸磷酸化而激活受體。受體激活后可活化細(xì)胞內(nèi)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng),包括PLCγ介導(dǎo)的PIP2水解及產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)第二信使分子、磷脂酰肌醇3激酶(PI-3 kinase)介導(dǎo)的磷酸酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)的生成、Ras蛋白介導(dǎo)的MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)廣泛的非受體酪氨酸蛋白激酶活性等。兩分子NGF結(jié)合于p75NTR可激活細(xì)胞內(nèi)JNK和NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡等過(guò)程,也可激活鞘磷脂酶分解細(xì)胞膜鞘磷脂產(chǎn)生神經(jīng)酰胺,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)一些復(fù)雜的生物過(guò)程。 神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生物學(xué)作用多是一種慢效應(yīng),依賴于對(duì)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的調(diào)控。但是,越來(lái)越多的證據(jù)表明,神經(jīng)生長(zhǎng)因子還表現(xiàn)出快速調(diào)節(jié)作用,如調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,神經(jīng)元突觸的傳遞,離子通道的功能和神經(jīng)元的興奮性等。 綜上所述,本實(shí)驗(yàn)以大鼠SCG神經(jīng)元為平臺(tái),觀察了交感神經(jīng)元興奮性與M電流的特征,及其二者的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上,觀察了NGF對(duì)M電流及神經(jīng)元興奮性的影響,并初步探討了可能的分子機(jī)制;此外,我們比較了NGF與傳統(tǒng)的M電流調(diào)節(jié)劑如M膽堿受體激動(dòng)劑Oxo-M和M通道阻斷劑linopirdine(LP)作用的異同和特點(diǎn)。 目的:分離培養(yǎng)大鼠SCG神經(jīng)元,利用膜片鉗技術(shù)記錄神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢缓蚆通道電流,(1)觀察SCG神經(jīng)元興奮性及M電流的特征;(2)確定神經(jīng)元興奮性及M電流的關(guān)系(3)觀察NGF、Oxo-M和LP影響神經(jīng)元興奮性的特征;(4)初步探討NGF對(duì)M通道作用的機(jī)制。 方法:(1)SCG神經(jīng)元的分離與培養(yǎng):取4-6周齡的SD大鼠,雌雄不限,迅速摘取其頸上神經(jīng)節(jié),經(jīng)過(guò)剪切、消化、洗酶、重懸、種植等過(guò)程,生化培養(yǎng)箱37°C,5%CO2+95%混合氣,培養(yǎng)1d后用于膜片鉗記錄。2d內(nèi)使用完。要求:無(wú)菌,低溫,操作迅速。(2)電生理學(xué)實(shí)驗(yàn):利用打孔膜片鉗技術(shù)和全細(xì)胞膜片技術(shù),記錄神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢缓碗x子通道電流,給予Oxo-M、LP、NGF等,觀察這些藥物對(duì)神經(jīng)元興奮性和通道電流的作用并分析其作用機(jī)制。要求:①相同條件的灌流給藥和②嚴(yán)格有效的實(shí)驗(yàn)對(duì)照。 結(jié)果:(1)根據(jù)在去極化電流的刺激下動(dòng)作電位爆發(fā)的個(gè)數(shù)不同,大鼠SCG中存在三種具有不同電生理特征的神經(jīng)元,分別為:phasic-1,只爆發(fā)一個(gè)動(dòng)作電位,占36.4%;phasic-2,占53.5%,緊密爆發(fā)2~6個(gè)動(dòng)作電位;tonic,持續(xù)爆發(fā)動(dòng)作電位,占10.1%。說(shuō)明SCG中以phasic神經(jīng)元為主。以動(dòng)作電位爆發(fā)的個(gè)數(shù)為主要指標(biāo),結(jié)合靜息電位、爆發(fā)的潛伏期及動(dòng)作電位間期、靜息電位與閾電位的差值等4個(gè)方面對(duì)三類(lèi)神經(jīng)元進(jìn)行比較,觀察它們興奮性的特點(diǎn)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明:三類(lèi)神經(jīng)元兩兩間比較動(dòng)作電位爆發(fā)個(gè)數(shù)均存在顯著的差異(p0.01),相同條件下tonic神經(jīng)元爆發(fā)的個(gè)數(shù)最多,phasic-2次之,phasic-1最少;phasic-1和phasic-2神經(jīng)元的靜息電位約-55mV,與tonic神經(jīng)元相比均存在顯著的差異(p0.01),后者的靜息電位較高,為-49.7mV;phasic-2和tonic動(dòng)作電位爆發(fā)的間期存在顯著的差異(p0.01)。說(shuō)明tonic神經(jīng)元的興奮性較phasic神經(jīng)元高。(2)三類(lèi)神經(jīng)元興奮性對(duì)遞增式注入電流的反應(yīng)性不同。Phasic-1神經(jīng)元在較大幅度的電流(200pA~300pA)注入時(shí)不增加其動(dòng)作電位的爆發(fā)個(gè)數(shù);phasic-2神經(jīng)元在較小幅度的電流(10pA~100pA)注入時(shí)動(dòng)作電位的爆發(fā)個(gè)數(shù)顯著增加,發(fā)放形式由phasic轉(zhuǎn)變?yōu)閠onic;tonic神經(jīng)元在微小幅度的電流(20pA~30pA)注入時(shí)即顯著增加動(dòng)作電位的爆發(fā)個(gè)數(shù),說(shuō)明phasic-2和tonic神經(jīng)元對(duì)注入電流的敏感較高,反應(yīng)性較好,phasic-1神經(jīng)元的興奮性狀態(tài)較穩(wěn)定。(3)三類(lèi)神經(jīng)元中M電流的大小和電生理學(xué)特征不同。以-60mV的尾電流為指標(biāo),phasic神經(jīng)元與tonic神經(jīng)元的M電流的大小存在顯著的差異(p0.01),后者的電流大小為33.7±3.36 pA (n=19),僅為前者的1/3,說(shuō)明Tonic神經(jīng)元的M電流較其它兩類(lèi)神經(jīng)元小。Tonic神經(jīng)元的I-V曲線較其它phasic神經(jīng)元右移,去活和激活的時(shí)間常數(shù)也較phasic神經(jīng)元顯著增加(p0.01),說(shuō)明tonic神經(jīng)元的M電流在較高的電壓下才能被激活,去活和激活的時(shí)間較長(zhǎng)。(4)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏谋l(fā)個(gè)數(shù)似乎與其M電流的大小有關(guān),M電流較小,爆發(fā)個(gè)數(shù)則多;M電流較大,爆發(fā)個(gè)數(shù)則少,呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。(5)Oxo-M和LP通過(guò)抑制M電流,可以不同程度地提高phasic和tonic神經(jīng)元的興奮性。對(duì)tonic神經(jīng)元影響最為顯著,phasic-2次之,phasic-1相對(duì)最不明顯。這可能與藥物對(duì)M電流的抑制率有關(guān)。(6)Oxo-M對(duì)phasic和tonic神經(jīng)元M電流的抑制率相同,均為75%左右,說(shuō)明神經(jīng)元興奮性的改變可能與其自身的興奮狀態(tài)和抑制后剩余的M電流的絕對(duì)大小有關(guān)。(7)NGF可以抑制SCG神經(jīng)元的M電流,但抑制程度遠(yuǎn)小于Oxo-M和LP對(duì)M電流的抑制,且長(zhǎng)時(shí)間沖洗M電流不能從抑制中恢復(fù)。對(duì)phasic和tonic神經(jīng)元的抑制率沒(méi)有差異。(8)NGF可以提高tonic神經(jīng)元的興奮性,但對(duì)phasic神經(jīng)元的興奮性沒(méi)有影響。這可能與NGF對(duì)M電流的抑制率較低,抑制后phasic神經(jīng)元剩余的M電流的較大,仍可以維持其原來(lái)的興奮性狀態(tài)有關(guān)。(9)在NGF抑制的基礎(chǔ)上,用Oxo-M加強(qiáng)對(duì)M電流的抑制程度,可以提高phasic神經(jīng)元的興奮性,進(jìn)一步說(shuō)明M電流抑制程度的大小與神經(jīng)元改變興奮性關(guān)系密切。 結(jié)論:(1)大鼠SCG中存在phasic-1、phasic-2和tonic三種不同電生理類(lèi)型的神經(jīng)元,以phasic神經(jīng)元為主。(2)phasic-1、phasic-2和tonic神經(jīng)元的興奮性及對(duì)電流刺激的敏感性和反應(yīng)性不同,tonic神經(jīng)元最高,phasic-2神經(jīng)元次之,phasic-1神經(jīng)元最低。(3)phasic-1、phasic-2和tonic神經(jīng)元M電流的大小和電生理學(xué)特征不同。Tonic神經(jīng)元的M電流較其它兩類(lèi)神經(jīng)元小,I-V曲線右移,需在較高的電壓下才能被激活,去活和激活的時(shí)間常數(shù)均較長(zhǎng)。(4)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏谋l(fā)個(gè)數(shù)與其M電流的大小呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性。M電流較小,爆發(fā)個(gè)數(shù)則多,反之亦然。(5)Oxo-M和LP對(duì)phasic和tonic神經(jīng)元M電流的抑制率相同,抑制M電流可以不同程度的提高兩類(lèi)神經(jīng)元的興奮性。(6)NGF對(duì)SCG神經(jīng)元M電流的抑制率較低,在phasic和tonic神經(jīng)元兩者間沒(méi)有差異,抑制M電流可以提高tonic神經(jīng)元的興奮性,對(duì)phasic神經(jīng)元的興奮性沒(méi)有影響。抑制后剩余的M電流的大小與神經(jīng)元的興奮性狀態(tài)有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R33

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1403271