本文關(guān)鍵詞：甲胎蛋白對樹突狀細(xì)胞功能及其凋亡的影響　出處：《吉林大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： DCs是目前公認(rèn)的體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cell,APC),它能激活靜息型T細(xì)胞,在抗原的加工、處理及傳遞過程中起重要的作用。尤其是其抗腫瘤功能,近年來受到越來越多的重視。AFP作為一種胚胎性腫瘤相關(guān)蛋白,可以在大80%的原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者血清中升高,在臨床上主要用于HCC的診斷、高危人群的普查及HCC手術(shù)或其他方法的療效評定。但是,隨著研究的深入人們發(fā)現(xiàn)AFP具有免疫抑制作用,它能有效抑制母體對胎兒的排斥,能抑制原發(fā)性肝癌病人免疫系統(tǒng)功能,促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡從而逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。然而,AFP是一種生物學(xué)活性非常復(fù)雜的蛋白質(zhì),其免疫抑制作用目前并未完全清楚。 為此,我們在成功制備人外周血來源DCs基礎(chǔ)上,在體外以不同濃度AFP處理DCs,著重探討AFP對DCs分化、成熟及其生物學(xué)功能的影響,以及AFP對DCs凋亡的影響及其機(jī)制。本研究從以下三個方面進(jìn)行: 1、人外周血來源DCs的體外擴(kuò)增及鑒定 人外周血單個核細(xì)胞為DCs前體細(xì)胞誘導(dǎo)成熟DCs,利用細(xì)胞的粘附附特性,對經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液初步純化細(xì)胞進(jìn)行分離,有效地將DCs前體細(xì)胞(主要為單核細(xì)胞)與非黏附細(xì)胞(主要為混和淋巴細(xì)胞)分離。誘導(dǎo)5天后,再次利用細(xì)胞的黏附特性,收集非貼壁DCs于新的培養(yǎng)板中培養(yǎng),可去除其它細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞等)對DCs生長的影響。外周血單個核細(xì)胞在聯(lián)合細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4及TNF-α作用下逐漸表現(xiàn)典型DCs形態(tài)。培養(yǎng)第9天的細(xì)胞顯示,該類細(xì)胞高表達(dá)表面分子HLA-DR,CDla,CD11c,共刺激分子CD80、CD86,成熟DCs特異性標(biāo)志CD83。并具有很強(qiáng)的刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力。從細(xì)胞表型,細(xì)胞形態(tài)學(xué)及混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)分析證實,從外周血單個核細(xì)胞中誘導(dǎo)分化的細(xì)胞為DCs。 2、AFP對DCs表型及功能的影響 為探討AFP對DCs增殖的影響,我們用不同濃度AFP(1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)處理培養(yǎng)第5天DCs細(xì)胞,孵育72 h。MTT法檢測DCs增殖情況。結(jié)果表明,AFP對DCs細(xì)胞的生長有一定的抑制作用,AFP濃度在1μg/ml到40μg/ml之間,隨著AFP濃度的增加,抑制作用逐漸加強(qiáng)。 為檢測AFP對DCs表型影響,用濃度為20μg/ml AFP處理培養(yǎng)第7天DCs細(xì)胞,培養(yǎng)24小時,加入6種抗體(Anti-HLA-DR,Anti-CD1a、Anti-抗CD83、Anti-CD80、Anti-CD86、Anti-CD11c),通過流式細(xì)胞儀檢測熒光并記錄結(jié)果。結(jié)果表明,AFP處理DCs的HLA-DR、CD1a、CD11c、CD80、CD83、CD86分子表達(dá)均明顯低于對照組,差異具有顯著性(P0.05) 為研究AFP對DCs刺激淋巴細(xì)胞增殖能力的影響進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。用不同濃度AFP處理DCs作為刺激細(xì)胞,異體淋巴細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞, MTT法于波長570 nm處檢測OD值。結(jié)果顯示,成熟DCs對淋巴細(xì)胞具有很強(qiáng)的刺激增殖作用,而未成熟DCs刺激淋巴細(xì)胞增殖能力相對較弱。各濃度的AFP對抑制刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力明顯低于對照組,且AFP濃度越高,DCs刺激淋細(xì)胞增殖能力越低。 3.AFP誘導(dǎo)DCs凋亡的體外研究 為研究AFP對DCs凋亡的影響,將DCs分為DCs+AFP、DCs+HSA、DCs+AFP+Anti-AFP、DCs+AFP+SB203580、DCs+AFP+DEVD-fmk5組,別分別加入AFP、HSA、AFP抗體、p38-MAPK通路阻斷劑SB203580、Caspase抑制劑DEVD-fmk,以未處理DCs為對照。培養(yǎng)24 h加入Annexin V-FITC及PI,流式細(xì)胞儀檢測DCs凋亡。結(jié)果顯示不同濃度的AFP均能促進(jìn)DCs凋亡,且隨著濃度的增加,DCs凋亡指數(shù)增加。加入SB203580及DEVD-fmk后凋亡指數(shù)下降,HSA及AFP+Anti-AFP未影響DCs凋亡。 為進(jìn)一步研究AFP誘導(dǎo)DCs凋亡的機(jī)制,我們用JC-1染色法檢測各組DCs線粒體膜電勢的變化,用Western法檢測各組DCs活性Caspase-3及磷酸化p38MAPK的表達(dá)情況。結(jié)果顯示在AFP(20μg/ml)誘導(dǎo)DCs凋亡的過程中伴隨著線粒體膜電勢的下降、活性Caspase-3及磷酸化p38MAPK的表達(dá)。與HSA組及AFP抗原抗體復(fù)合物組相對照說明是AFP導(dǎo)致線粒體膜電勢的下降,誘導(dǎo)caspase-3及p38MAPK的表達(dá)。其中,Caspase抑制劑DEVD—fmk能阻斷AFP誘導(dǎo)的DCs凋亡,使活性Caspase-3表達(dá)下降,但未影響線粒體膜電勢的下降及p38MAPK的高表達(dá)。p38MAPK抑制劑SB203580能夠明顯減少AFP誘導(dǎo)的DCs凋亡,部分阻止線粒體膜電勢的下降,抑制活性Caspase-3及磷酸化p38MAPK的表達(dá)。 綜上所述:(1)AFP下調(diào)DCs表面分子的表達(dá),抑制其刺激淋巴細(xì)胞增殖能力;(2)AFP可能通過線粒體途徑促進(jìn)DCs的凋亡;(3)p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能參與AFP介導(dǎo)的DCs凋亡;(4)AFP可能通過“AFP—p38MAPK—線粒體—Caspase”信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模式誘導(dǎo)DCs凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1403124