發(fā)布時間：2018-01-05 17:31

  本文關鍵詞：結核分枝桿菌38kD蛋白表達載體的構建和重組38kD蛋白純化及鑒定　出處：《華南熱帶農業(yè)大學》2006年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 據世界衛(wèi)生組織統計,全世界現有結核病人3000萬,每年新發(fā)生約900萬例,每年死亡300萬人。目前結核病還沒有很理想的診斷技術。結核病的診斷尤其是早期的診斷對結核病的防治有著非常關鍵的作用。結核菌38kD蛋白具有強免疫性,特異性高于混合蛋白制成的抗體檢測試劑,能將結核病患者與BCG接種陽轉健康者區(qū)分開來。38kD蛋白在結核病血清學診斷上有很好的應用前景。 本實驗研究目的,是通過結核分枝桿菌38kD蛋白基因克隆及大腸桿菌表達載體的構建,以轉基因技術導入大腸桿菌,誘導表達,純化,并鑒定該蛋白,以獲得大量38kD抗原。 根據結核菌編碼38kD蛋白的基因系列,設計一對特異引物,通過PCR技術從結核菌H37Rv基因組DNA擴增出38kD蛋白基因片段,成功連接到克隆載體pMD 18-T Simple Vector。測序鑒定為正確的38kD蛋白基因;目的片段克隆到原核表達載體pET-30a中,成功構建成帶有C端6His-tag的融合表達載體。利用化學轉化法將重組表達載體轉化E. coli BL21(DE3),PCR檢測獲得陽性的工程菌株;經IPTG誘導和十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析,本試驗成功獲得了能夠表達的工程菌株。搖瓶培養(yǎng)確定工程菌搖瓶發(fā)酵最適溫度為37℃,發(fā)酵時間最短時間為0.5h,此時可達到最大表達量。誘導劑IPTG最小使用濃度為0.5 mmol/L。表達方式分析發(fā)現該重組蛋白在大腸桿菌中主要以包涵體的形式存在。并對包涵體進行純化純度達到90%。利用鎳瓊脂糖凝膠FF親和柱層析對重組蛋白進行了初步的純化研究。SDS-PAGE和免疫印跡法( Western blotting )檢測表明我們獲得純化的重組38kD蛋白。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和免疫印跡實驗結果說明重組38kD蛋白可被結核病病人血清識別,進一步鑒定重組蛋白就是結核菌38kD蛋白,也說明了重組38kD蛋白具有良好的免疫反應性,可用于結核病的免疫學診斷。 本研究獲得了能夠表達結核菌38kD蛋白的重組工程菌株,摸索出蛋白表達的合適條件,初步證實重組38kD蛋白具有良好的免疫反應性,為結核病的免疫學診斷打下了基礎。
[Abstract]:TB 38 kD protein has strong immunity and specificity higher than that of mixed protein . The 38 kD protein has good application prospect in the diagnosis of tuberculosis serologic . The purpose of this experiment was to clone the 38kD protein gene of Mycobacterium tuberculosis and construct the expression vector of E . coli , introduce the gene into E . coli , induce expression , purify , and identify the protein to obtain a large amount of 38 kD antigen . coli BL21 ( DE3 ) was cloned into prokaryotic expression vector pET - 30a . The recombinant protein was cloned into prokaryotic expression vector pET - 30a . The recombinant protein was cloned into E . coli BL21 ( DE3 ) . This study has obtained the recombinant engineering strain capable of expressing the 38kD protein of mycobacterium tuberculosis , and finds out the suitable conditions for the expression of the protein , and preliminarily proves that the recombinant 38kD protein has good immunoreactivity and lays a foundation for the immunological diagnosis of tuberculosis .

【學位授予單位】：華南熱帶農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R346;Q78

【引證文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 王勝;Cry1Aa-CpTI融合蛋白的原核表達及其對斜紋夜蛾殺蟲活性研究[D];海南大學;2010年

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本文編號：1384137