發(fā)布時間：2018-01-04 17:08

  本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲18kDa天然分子抗原及其候選基因疫苗的研究　出處：《中南大學(xué)》2006年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 日本血吸蟲 亞克隆 分離純化 疫苗 免疫保護

【摘要】： 目的：篩選和鑒定新的有價值的日本血吸蟲疫苗候選分子，為天然分子多價復(fù)合疫苗的制備提供實驗依據(jù)。本論文對日本血吸蟲不同靶分子量大小的天然抗原分子進行了分離純化與鑒定，針對SjAWA18kDa分子抗原進行免疫生化特性研究，并比較了SjAWA18kDa天然分子抗原及其相關(guān)編碼候選基因SJCWL01DNA免疫小鼠產(chǎn)生的抗血吸蟲病免疫保護效果。 方法：1采用柱層析方法和SDS-PAGE結(jié)合凝膠洗脫分離純化日本血吸蟲成蟲(SjAWA)和未成熟蟲卵可溶性抗原(SIEA)，SDS-PAGE結(jié)合銀染色、考馬斯亮蘭染色進行分析鑒定。2采用多途徑免疫法制備SjAWA18kDa純化抗原的單特異免疫血清，以此為探針進行免疫學(xué)分析。3將篩選尾蚴cDNA文庫獲得的新基因(編碼18kDa蛋白，命名為SJCWL01，GENBANK登錄號為AY855919)克隆入真核表達載體pcDNA3，經(jīng)PCR、限制性酶切篩選和鑒定陽性克隆。將pcDNA3／SJCWL01質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α、大量制備DNA疫苗；將該天然分子抗原編碼候選基因與SjAWA18kDa免疫小鼠，然后經(jīng)腹部皮膚感染40±1條日本血吸蟲尾蚴，45天后剖殺，計算減蟲率和減卵率。采用免疫組化法檢測重組DNA疫苗SJCWL01在局部肌肉組織中的表達。 結(jié)果：1通過柱層析法或SDS-PAGE結(jié)合凝膠洗脫得到了五種不同大小血吸蟲分子抗原SjAWA18kDa，SjAWA26／28kDa，SIEA42kDa，SIEA130kDa，SjAWA14kDa。2成功制備了抗日本血吸蟲18kDa單特異兔血清，SjAWA18kDa與新基因編碼的重組融合蛋白有共同的抗原表位。免疫組化顯示SjAWA18kDa主要定位于成蟲的腸上皮、表皮和實質(zhì)細胞。3將SJCWL01基因亞克隆至pcDNA3，然后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，大量制備純化的重組質(zhì)粒DNA(pcDNA3／SJCWL01)；以此重組DNA和SjAWA18kDa天然分子免疫小鼠，分別獲得了27.6％，30.7％減蟲率，，39.5％和50.7％減卵率。免疫組化結(jié)果顯示SJCWL01在小鼠骨胳肌的細胞漿中得到表達。 結(jié)論：1實驗證明柱層析法或SDS-PAGE電泳切膠、結(jié)合凝膠洗脫是一種快速分離純化血吸蟲單一組分抗原簡單而有效的方法。2成功制備了抗SjAWA18kDa血清，SjAWA18kDa主要定位于成蟲的腸腔和實質(zhì)細胞。3成功構(gòu)建了天然分子抗原編碼候選基因(18kDa)DNA疫苗，該疫苗與SjAWA18kDa可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生部分抗血吸蟲感染的保護力。
[Abstract]:Objective: screening and identification of new valuable Schistosoma japonicum vaccine candidate molecules, provide an experimental basis for the natural molecular multivalent vaccine preparation. The natural antigens of Schistosoma japonicum in different target molecular size of isolation and identification of immune, biochemical characteristics for SjAWA18kDa molecular antigen, and compared the anti effect of schistosomiasis immune protection in mice immunized with SjAWA18kDa molecular antigen and related candidate gene SJCWL01DNA encoding.
Methods: 1 by column chromatography and SDS-PAGE method combined with gel elution purification of Schistosoma japonicum (SjAWA) and soluble immature egg antigen (SIEA), SDS-PAGE combined with silver staining, Kaumas bright blue were identified by.2 analysis of immune preparation single specific immune serum SjAWA18kDa purified antigen by multi-channel staining to identify novel genes for cercariae cDNA Library as a probe for immunological analysis of.3 (encoding 18kDa protein, named SJCWL01, GENBANK accession No. AY855919) was cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3 by PCR, restriction enzyme screening and identification of positive clones. The pcDNA3 / SJCWL01 plasmid was transformed into Escherichia coli DH5 alpha, a preparation of the DNA vaccine; molecular antigen encoding candidate genes in mice immunized with SjAWA18kDa, then the abdominal skin infection 40 + 1 cercariae, 45 days after the killing, calculating the worm reduction rate and egg reduction Rate. Immunohistochemical method was used to detect the expression of recombinant DNA vaccine SJCWL01 in local muscle tissue.
Results: 1 by column chromatography or gel elution with SDS-PAGE got five different size of Schistosoma japonicum antigen SjAWA18kDa, SjAWA26 / 28kDa, SIEA42kDa, SIEA130kDa, anti Schistosoma japonicum 18kDa single specific rabbit serum was prepared successfully with SjAWA18kDa SjAWA14kDa.2, the new gene encoding the recombinant fusion proteins have a common epitope. Immunohistochemistry showed that SjAWA18kDa was mainly localized in adult intestinal epithelial, epidermal and parenchymal cells of.3 SJCWL01 gene was subcloned into pcDNA3, then transformed into Escherichia coli, the recombinant plasmid DNA was purified for the (pcDNA3 / SJCWL01); the recombinant DNA and SjAWA18kDa molecular immunized mice were obtained respectively 27.6%, 39.5% and 30.7% of worm reduction rate 50.7% egg reduction rate. Immunohistochemistry showed that the expression of SJCWL01 in cytoplasm of mouse skeletal muscle.
Conclusion: the experiment proved that the 1 column chromatography or SDS-PAGE electrophoresis, gel elution is a rapid purification method of schistosome antigen of simple and effective single group.2 were successfully prepared anti SjAWA18kDa serum, SjAWA18kDa was mainly located in the adult intestinal cavity and parenchymal cells.3 successfully constructed molecular antigen encoding gene (18kDa) DNA vaccine, the vaccine and SjAWA18kDa can protect part against the infection of Schistosoma japonicum in mice.

【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R392

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本文編號：1379297