本文關(guān)鍵詞：人胚胎干細胞建系、初步鑒定及應用不同方法冷凍人胚胎干細胞的研究　出處：《天津醫(yī)科大學》2007年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 人胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)是指來源于人囊胚內(nèi)細胞團(inner cell mass，ICM)或人原始生殖細胞(human primordial germ cells)的多能性細胞，它在體外能無限增殖并保持正常的細胞核型，具有分化為三個胚層的各種組織的潛能。hESCs系的建立對再生醫(yī)學、藥理學及基礎科學研究具有深遠的應用價值。目前，許多研究機構(gòu)都在進行hESC建系的相關(guān)研究工作。大多數(shù)生殖中心在進行體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)時通常使用D_3的胚胎進行移植，移植后常有許多剩余質(zhì)量差的廢棄胚胎，將這些D_3廢棄胚胎收集起來進行培養(yǎng)，部分胚胎可發(fā)育成囊胚，本實驗利用這些囊胚的內(nèi)細胞團，以人胚胎肺組織成纖維細胞(human embryonic pulmonary fibroblasts，HEPFs)作為飼養(yǎng)層，進行了hESC建系及鑒定的初步研究。還有一部分患者已妊娠分娩成功，她們自愿簽署知情同意書，將其多余的冷凍胚胎用于科學研究，本實驗將這些胚胎解凍后進行培養(yǎng)，部分也可發(fā)育成囊胚，對其也進行了hESCs建系及鑒定的相關(guān)研究。hESCs建系成功后的另一個重要環(huán)節(jié)就是細胞的有效凍存，本實驗采用慢速冷凍、玻璃化冷凍及程序降溫冷凍三種不同方法凍存同一代數(shù)的hESCs，并將解凍后hESCs的細胞復蘇率、克隆生長及分化情況進行對比分析，同時對解凍后的hESCs的全能性進行了鑒定。 研究分為三部分：第一部分，應用體外受精廢棄胚胎建立hESCs系；第二部分，對所建立hESCs系的鑒定；第三部分，hESCs低溫凍存方法比較。 本實驗共收集了177個D_3廢棄胚胎，形成囊胚47個；解凍胚胎23個，形成囊胚7個。hESCs系的建立與囊胚的質(zhì)量和ICM所形成的原代克隆的生長情況密切相關(guān)，質(zhì)量好的囊胚分離培養(yǎng)獲得的hESCs傳代效率高，，原始生長速度快的ICM所形成的原代克隆傳代效率高。我們將來源于優(yōu)質(zhì)囊胚的ICM接種于飼養(yǎng)層后已經(jīng)建立了4個hESCs系，分別命名為hESCs-060909、hESCs-060927、hESCs-061005和hESCs-061124，其中hESCs-061124來源于解凍胚胎形成的優(yōu)質(zhì)囊胚。 hESCs系的鑒定包括對hESCs的細胞形態(tài)、表面標記物(alkaline phosphatase，TRA-1-60，TRA-1-81，SSEA-1，SSEA-3，SSEA-4)及核型的鑒定。我們對hESCs-060909 P_(20)，hESCs-060927 P_(15)，hESCs-061124 P_6進行了AKP檢測，克隆呈紫紅色陽性反應。對hESCs-060909 P_(20)和hESCs-060927 P_(15)進行了免疫組化檢測：未分化的hESCs克隆SSEA-1不著色，呈陰性反應；SSEA-3染色較淺，呈部分陽性反應；SSEA-4染色深，呈陽性反應；TRA-1-60呈陽性反應。對hESCs-060909 P_(20)進行了核型檢測，核型為46，XY，表明其具有正常的二倍體核型；對hESCs-060927 P_(15)進行了核型檢測，核型為46，XX，表明其具有正常的二倍體核型。 本實驗探討了三種不同方法冷凍保存hESCs的效率。將傳統(tǒng)慢速冷凍、玻璃化冷凍及程序降溫冷凍三種方法凍存的hESCs解凍后進行比較，分析了不同方法對hESCs的細胞復蘇率、克隆生長和分化情況的影響。用機械法將培養(yǎng)皿中同一細胞系同代的hESCs進行分離，共獲得93個相似大小的hESCs細胞團塊，將其分為三組凍存：31個進行慢速冷凍，31個進行玻璃化冷凍，其余31個進行程序化冷凍。一周后將凍存的hESCs解凍，對不同凍存方法的hESCs復蘇率(復蘇率=回收細胞團塊數(shù)目／冷凍細胞團塊數(shù)目)進行對比：玻璃化法組復蘇率為35.5％，程序化冷凍組復蘇率為16.1％，慢速冷凍組的復蘇率為12.9％。其中玻璃化法組與慢速冷凍組相比較，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，認為玻璃化法能更有效的保存人胚胎干細胞。其余兩兩比較，均無統(tǒng)計學意義。我們也將應用三種凍存方法解凍后的hESCs的細胞形態(tài)，克隆生長和分化情況進行了對比，玻璃化法組比其它兩組的hESCs形態(tài)好，克隆生長速度較快且不易分化。最后，我們對解凍后的hESCs的全能性進行了鑒定，三組解凍后的hESCs核型分析正常，AKP陽性，SSEA-1陰性，SSEA-3部分陽性，SSEA-4陽性。
[Abstract]:Human embryonic stem cells ( hESCs ) are multipotent cells derived from inner cell mass ( ICM ) or human primordial germ cells ( human primordial germ cells ) . The research is divided into three parts : the first part , the application of the hESCs system in vitro fertilization , the second part , the identification of the established hESCs system , the third part , the hESCs low - temperature freezing method comparison . In this experiment , 177 D _ 3 discarded embryos were collected , 47 of them were formed , 23 of thawed embryos were thawed , and 7 of them were formed . The establishment of hESCs system was closely related to the quality of the blastocyst and the growth of the primary clone formed by ICM . Four hESCs were established after the ICM was inoculated into the feeder layer . The hESCs - 061,hESCs - 060927 , hESCs - 061005 and hESCs - 061124 were respectively named hESCs - 061124 . Immunohistochemical analysis of hESCs - 060909 P _ ( 20 ) , hESCs - 060927 P _ ( 15 ) , hESCs - 061124 P _ 6 was performed on hESCs - 060909 P _ ( 20 ) , hESCs - 061124 P _ 6 . The results showed that the recovery rate of hESCs was 35 . 5 % , the recovery rate of the frozen group was 16.1 % , and the recovery rate of the slow freezing group was 12.9 % .

【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R321-33

【參考文獻】

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本文編號：1372396