本文關鍵詞：人外周血內(nèi)皮前體細胞的體外誘導與培養(yǎng)　出處：《山東大學》2005年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： EPCs 分離 培養(yǎng) 誘導 分化 表面標志

【摘要】：胚胎發(fā)生時期,內(nèi)皮前體細胞(endothelial progenitor cells EPCs)參與了原始血管形成的最初過程(血管發(fā)生)。已有的證據(jù)顯示,發(fā)育為內(nèi)皮細胞(endothelial cells ECs)的前體也存在于成人中,正常情況下,EPCs停留在成人的骨髓,但是,可以通過細胞因子或血管生成因子信號被動員到循環(huán)血,遷移到生理或病理條件下的新血管形成位點,并原位分化成內(nèi)皮細胞,有助于血管新生(成人的血管發(fā)生)。目前,出生后血管發(fā)生的研究是臨床研究的熱點問題,自源的EPCs原位動員或移植是治療性血管再生的一個潛在、有效的方法,而且,內(nèi)皮前體也代表了阻止腫瘤生長的一個潛在的靶位。因此,要達到真正的臨床應用,首選的問題之一就是探索EPCs的分離、培養(yǎng)與鑒定。 本論文旨在探討人外周血EPCs的分離、體外誘導與分化,以及培養(yǎng)與鑒定,并研究其體外的生物學活性,為血管生成的細胞治療提供參考依據(jù)。 Ficoll液作為單個核細胞的提取液,用新鮮、抗凝的全血和抗凝血靜置后取富集單個核細胞層這兩種方法提取單個核細胞,分離的細胞濃度調整為1.0×10~6個/ml,接種在24孔培養(yǎng)板上,培養(yǎng)液分別用含有促血管生長因子VEGF、bFGF、IGF、EGF等的內(nèi)皮生長基質EGM-2和不含血管生長因子的內(nèi)皮基礎培養(yǎng)液EBM,第4d移走非黏附細胞,繼續(xù)培養(yǎng)黏附細胞,黏附細胞與Dil-AC-LDL和FITC標記的UEA-1一起孵育,熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。第7d,收集黏附細胞,流式細胞儀檢測其表面標志CD34、CD31、CD45、KDR的表達。 結果顯示,用抗凝血靜置后取富集單個核細胞層的方法提取單個核細胞,既縮短時間又排除了過多紅細胞的干擾。Dil-AC-LDL和FITC標記的UEA-1雙陽性的細胞在熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡下都能看到。細胞培養(yǎng)7d后,FACS分析,CD34+、CD31+、KDR+的表達分別為2.79%、6.27%、31.24%,而CD45表達呈陰性。 由此得出結論:外周血中確實存在EPCs,并且在血管生長因子VEGF、bFGF、IGF、EGF等的刺激下能分化為成熟的Ecs。
[Abstract]:During embryogenesis, endothelial progenitor cells (endothelial progenitor cells EPCs) participate in the initial process of primitive blood vessel formation (angiogenesis). The evidence shows that the growth of endothelial cells (endothelial cells ECs) precursors also exist in the adult, normal condition, EPCs stay in the adult bone marrow, but through cytokine or angiogenic growth factor signals were mobilized into circulation, migrate to the new vascular physiological or pathological conditions and in situ formation sites, differentiate into endothelial cells contribute to angiogenesis (adult blood Guan Fasheng). At present, research on angiogenesis after birth is a hot issue in clinical research, from the source EPCs in situ mobilization or transplantation is a potential therapeutic angiogenesis, and effective method, endothelial precursors also represents a potential target to prevent tumor growth. Therefore, to achieve the real clinical One of the first problems in application is to explore the isolation, culture and identification of EPCs.
The purpose of this study is to explore the isolation, induction and differentiation, culture and identification of human peripheral blood EPCs, and to study its biological activity in vitro, so as to provide reference for angiogenesis therapy.
Ficoll solution as extraction liquid, mononuclear cells with fresh blood, anticoagulation and anti coagulation after static enrichment of mononuclear cell layer of the two extraction methods of mononuclear cells, isolated cell concentration was adjusted to 1 * 10~6 /ml, were cultured on 24 well plates respectively, with vascular growth factor VEGF, bFGF, IGF medium, the growth of endothelial basal endothelial EGF matrix do not contain EGM-2 and vascular endothelial growth factor EBM of the medium, the 4D removal of non adherent cells, cultured cell adhesion, cell adhesion and Dil-AC-LDL and FITC labeled UEA-1 incubated together, fluorescence microscopy and laser scanning confocal microscope - 7d, collect the adherent cells, to detect the surface markers of CD34, CD31, CD45, flow cytometry, and the expression of KDR.
The results showed that using the method of static anti coagulation after enrichment of mononuclear cells from mononuclear cells, not only shorten the time and eliminate excessive interference of red cell.Dil-AC-LDL and FITC labeled UEA-1 double positive cells under fluorescence microscope and confocal microscope. Cell culture can be seen after 7d, FACS analysis CD34+, CD31+, and KDR+ expression were 2.79%, 6.27%, 31.24%, and CD45 negative expression.
It is concluded that EPCs does exist in peripheral blood and can be differentiated into mature Ecs. under the stimulation of vascular growth factor VEGF, bFGF, IGF, EGF and so on.

【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：R329

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