本文關鍵詞：超聲聯合脂質體微氣泡介導反義寡核苷酸轉染的實驗研究　出處：《中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院》2006年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 超聲 造影劑 反義寡核苷酸 轉染

【摘要】：目的:研究超聲介導脂質體微氣泡造影劑轉染反義寡核苷酸的有效性與安全性,探討超聲聯合微氣泡造影劑增強轉染的機制。 材料和方法: 1、體外實驗:12孔板培養(yǎng)人乳腺癌細胞并分組為:① 單純超聲照射;② 單純造影劑;③ 單純反義寡核苷酸HA2741(HA2741);④ 超聲照射+HA2741;⑤ 造影劑+HA2741;⑥ 造影劑+HA2741+超聲照射;⑦脂質體+HA2741;⑧脂質體+HA2741+超聲照射。超聲儀探頭發(fā)射頻率1.3MHz,聲波發(fā)射強度-18.0～0dB,照射時間5～240s,微氣泡濃度0.5～30%,反義寡核苷酸HA2741濃度為12～200nmol/L,給予實驗刺激后,熒光顯微鏡動態(tài)觀察5′-FAM修飾的HA2741的轉染率,碘化丙啶PI染色后觀察細胞的活性,采用RT-PCR的方法檢測HER-2 mRNA的水平,免疫細胞化學檢測HER-2蛋白的表達,原子力顯微鏡(AFM)觀察細胞膜形態(tài)的改變。 2、體內實驗:健康大鼠分為:① 對照組;② 單純反義寡核苷酸cy5ODN組;③ 造影劑+cy50DN組;④ 超聲+cy5ODN組;⑤ 超聲+造影劑+cy5ODN組。改變造影劑濃度與超聲照射時間,予與實驗刺激后,激光共聚焦顯微鏡檢測熒光表達強度,RT-PCR的方法檢測CTGF的mRNA的水平,Westem Blot檢測CTGF蛋白表達水平,檢測血清中GPT、GOT、BUN、Cr水平,以評價該方法的負作用。 結果: 1、體外實驗:造影劑+HA2741+超聲照射組HA2741的轉染迅速,轉染率顯著高于其余各組,約94.6%,是超聲照射+HA2741組的22.5倍,造影劑+HA2741組的30.5倍,脂質體+HA2741組的8.3倍;造影劑濃度2%、5%時轉染效率最高,提高造影劑濃度,轉染效率無改變,細胞活性顯著下降。聲波發(fā)射強度-3.0～6.0dB,照射時間30～60s,細胞轉染效率最高。乳腺癌細胞的HER-2 mRNA的水平降低,HER-2蛋白表達下調,其程度與HA2741轉染率呈負相關。單純超聲照射組及造影
[Abstract]:Objective: To investigate the efficacy and safety of ultrasound mediated liposome microbubbles in transfection of antisense oligonucleotides, and to explore the mechanism of ultrasound combined with microbubble contrast agent in enhancing transfection.
Materials and methods:
1, in vitro experiments: 12 pore plate cultured human breast cancer cells are grouped as follows: simple ultrasound irradiation; the contrast agent alone; the simple HA2741 antisense oligonucleotide (HA2741); the ultrasound contrast agent +HA2741 +HA2741; 5; the contrast agent +HA2741+ ultrasonic irradiation; the liposome and liposome +HA2741+ + HA2741; ultrasound irradiation. Ultrasound probe frequency 1.3MHz, acoustic emission intensity of -18.0 ~ 0dB, irradiation time was 5 ~ 240s, the micro bubble concentration of 0.5 ~ 30%, HA2741 antisense oligonucleotide concentration is 12 ~ 200nmol/L, experimental stimulation, fluorescence microscope and dynamic modification of HA2741 '-FAM 5 transfection rate, cell viability was iodide propidium PI staining, RT-PCR assay was used to measure the HER-2 levels of mRNA, HER-2 protein expression was detected by immunocytochemistry, atomic force microscopy (AFM) to observe the morphological changes of the cell membrane.
2 in vivo experiment: healthy rats were divided into the control group; the simple antisense oligonucleotide of cy5ODN group; the contrast group +cy50DN and group +cy5ODN; ultrasound; ultrasound contrast agent + +cy5ODN group. The change of contrast agent concentration and ultrasonic irradiation time, to experiment and stimulation, the fluorescence confocal microscopy expression strength, RT-PCR method to detect the CTGF mRNA level, the expression level of CTGF protein was detected by Westem Blot, serum GPT, GOT, BUN, Cr, with a negative effect evaluation of the method.
Result:
1, in vitro: transfection of contrast agent +HA2741+ ultrasound irradiation group HA2741 rapidly, the transfection rate was significantly higher than the other groups, about 94.6%, is 22.5 times of ultrasonic irradiation in +HA2741 group, 30.5 times of contrast agent in +HA2741 group, 8.3 times of liposome group +HA2741; contrast agent concentration of 2%, 5% of the highest transfection efficiency, increase the contrast agent concentration, transfection efficiency, cell activity decreased significantly. The acoustic emission intensity of -3.0 ~ 6.0dB, irradiation time was 30 ~ 60s, the highest transfection efficiency. Breast cancer cells HER-2 reduced levels of mRNA, HER-2 protein expression, the degree and the transfection rate of HA2741 was negatively related to simple ultrasound irradiation group and contrast.

【學位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R346

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