本文關鍵詞：腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（TRAIL）基因的改造及其在畢赤氏酵母菌中的表達分析　出處：《華南熱帶農(nóng)業(yè)大學》2005年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體 甲醇畢赤酵母 高效表達 篩選

【摘要】：腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL)是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)基因超家族眾多成員之一,能通過死亡受體的參與而誘導細胞凋亡。 TRAIL與腫瘤細胞膜表面特殊的復雜的受體系統(tǒng)(兩個死亡受體和三個誘騙受體)相互作用。由于它的三聚體形式能誘導許多轉化細胞凋亡卻不會殺傷正常細胞的特性而有望成為極有潛力的治療腫瘤的藥物,引起研究者極大的興趣。 本研究利用甲醇畢赤氏酵母表達系統(tǒng)對TRAIL基因進行了表達研究和高效表達菌株的篩選。以pGEM-TRAIL為模板,設計了三對引物P1、P2、P3、P4、P5、P6,利用套疊PCR技術成功地獲得了含有KEX2位點和ATTTA位點以及同時含有這兩個突變位點的可溶性TRAIL基因片段,并成功地克隆到E.coli DH5α中擴增。 將改造后的TRAIL基因連接到甲醇畢赤酵母Pichia pastoris的YIP型表達載體上,通過Zeocin抗生素篩選,Xba Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切鑒定,獲得重組表達載體pPICZ_α-A-TRAIL_(unmodified)、pPICZ_α-A-TRAIL_(KEX2 mutation)、pPICZ_α-A-TRAIL_(ATTTA mutation)、pPICZ_α-A-TRAIL_(KA double mutation)。 利用電轉化技術將重組表達載體轉化畢赤酵母GS115,經(jīng)Zeocin抗生素篩選、PCR檢測獲得陽性的酵母工程菌株pPICZ_α-A-TRAIL_(unmodified)/GS115、pPICZ_α-A-TRAIL_(KEX2 mutation)/GS115、pPICZ_α-A-TRAIL_(ATTTA mutation)/GS115、pPICZ_α-A-TRAIL_(KA double mutation)/GS115。 搖瓶培養(yǎng)確定畢赤酵母工程菌搖瓶最適pH值為5.5-6.5;最佳甲醇誘導濃度為1%;最適誘導周期為96 h。 利用SDS-PAGE進行高表達菌株的篩選,得到高表達菌株,表達水平分別達到71.5 mg/L(對照)、127.5 mg/L、114 mg/L和183 mg/L,這說明改造后的菌株表達量比未突變的菌株表達量有較明顯的提高。 利用CM-柱層析對重組蛋白進行了初步純化研究。用Western blot檢測表明重組蛋白具有TRAIL抗原活性。MTT法檢測表達菌株發(fā)酵產(chǎn)物顯示重組蛋白具有生物活性。
[Abstract]:TNF - related apoptosis inducing ligand ( TRAIL ) associated with tumor necrosis factor is one of the many members of tumor necrosis factor ( TNF ) gene superfamily , which can induce apoptosis by the involvement of death receptor . TRAIL interacts with a specific complex receptor system ( two death receptors and three decoy receptors ) on the surface of the tumor cell membrane . Because of its trimer form , it is expected that many transformed cells will not kill normal cells but are expected to be extremely potential drugs for the treatment of tumors , causing great interest in the researchers . Three pairs of primers P1 , P2 , P3 , P4 , P5 and P6 were designed by using Pichia pastoris expression system . Three pairs of primers P1 , P2 , P3 , P4 , P5 and P6 were designed . The modified TRAIL gene was ligated to YIP expression vector of Pichia pastoris , and was screened by Zeocin antibiotic and Xba I / Xho I double digestion . The recombinant expression vector pZ偽 - A - TRAIL _ ( inducer ) , ZZ _ 偽 - A - TRAIL _ ( ATTTA mutation ) and ZZ _ 偽 - A - TRAIL _ ( KA double mutation ) were obtained . The recombinant expression vector was transformed into Pichia pastoris GS115 by electroporation . After Zeocin antibiotic screening , the positive yeast engineering strains were screened by PCR . The positive yeast engineering strains were identified by PCR . The positive yeast strains were GS115 , ZZ _ 偽 - A - TRAIL _ ( KEX2 mutation ) / GS115 , ZZ _ 偽 - A - TRAIL _ ( ATTTA mutation ) / GS115 , ZZ _ 偽 - A - TRAIL _ ( KA double mutation ) / GS115 . pPICZ_偽-A-TRAIL_(KEX2 mutation)/GS115,pPICZ_偽-A-T High - expression strains were screened by SDS - PAGE . The expression levels of the strains were 71.5 mg / L ( control ) , 127.5 mg / L , 114 mg / L and 183 mg / L , respectively . The recombinant protein was purified by CM - column chromatography . Western blot was used to detect the activity of recombinant protein .

【學位授予單位】：華南熱帶農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：R346

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 關良,馮健男,王國華,劉少君,王翔;人突變型TRAIL在大腸桿菌中的表達及誘導多種腫瘤細胞的凋亡[J];軍事醫(yī)學科學院院刊;2003年01期

2 關良,馮健男,王國華,闕海萍,劉少君;人突變型TRAIL體外誘導腦惡性膠質(zhì)瘤細胞凋亡的研究[J];中華神經(jīng)外科雜志;2004年04期

3 李小安,房殿春,司佩任,張汝剛,楊柳芹,蔣明德,秦建平;TRAIL與5-Fu合用對結腸癌細胞系SW480殺傷作用的研究[J];第三軍醫(yī)大學學報;2003年18期

4 戴丹菁;謝叢華;張阿麗;邱慧兵;周遵艷;;TRAIL聯(lián)合放射線誘導人腦膠質(zhì)瘤細胞株U251凋亡的協(xié)同作用研究[J];武漢大學學報(醫(yī)學版);2006年06期

5 段德宇;鄭啟新;邵增務;王洪;劉勇;潘海濤;;TRAIL聯(lián)合多柔比星作用于骨肉瘤的實驗研究[J];中國癌癥雜志;2007年01期

6 王吉剛;TRAIL與惡性血液系統(tǒng)腫瘤治療[J];重慶醫(yī)學;2004年03期

7 周兆群;陳輝;邵小松;陸超;江濤;王曉榕;;Smac基因過表達增強腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體誘導神經(jīng)母細胞瘤細胞凋亡[J];實用兒科臨床雜志;2008年15期

8 任秀花,張華,吳紅霞,閻愛華;食管癌發(fā)生發(fā)展過程中TRAIL和Survivin蛋白的表達研究[J];河南腫瘤學雜志;2005年05期

9 冷向鋒;王德昌;張秋;馮永強;王坤;肖虎;霍然;薛文君;;嚴重燒傷大鼠腎臟細胞凋亡及其機制的研究[J];中華燒傷雜志;2006年02期

10 李淑蓮;趙粵萍;都景芳;劉廣超;;阿霉素對HL-60、K562細胞表面DR5表達的影響[J];河南大學學報(醫(yī)學版);2006年02期

相關會議論文 前5條

1 周慧明;陳智;;腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體誘導肝癌細胞凋亡的實驗研究[A];第十二次全國中西醫(yī)結合肝病學術會議論文匯編[C];2003年

2 陳敏;高虹;梁新樂;;云芝漆酶基因在畢赤酵母中的表達研究[A];中國食品科學技術學會第五屆年會暨第四屆東西方食品業(yè)高層論壇論文摘要集[C];2007年

3 陳敏;高虹;梁新樂;;云芝漆酶基因在畢赤酵母中的表達研究[A];中國食品科學技術學會第五屆年會暨第四屆東西方食品業(yè)高層論壇論文摘要集[C];2007年

4 付建芳;姬秋和;黃威權;張南雁;;橋本甲狀腺炎中腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)及其死亡受體(TRAILR1、TRAILR2)的表達[A];中華醫(yī)學會第六次全國內(nèi)分泌學術會議論文匯編[C];2001年

5 賈筱琴;李厚達;;重組分泌型TRAIL的構建及體內(nèi)外抑瘤效應的初步研究[A];中國實驗動物學會第六屆學術年會論文集[C];2004年

相關博士學位論文 前5條

1 王吉剛;TRAIL逆轉白血病骨髓基質(zhì)細胞粘附介導Jurkat細胞耐藥的研究[D];第三軍醫(yī)大學;2005年

2 僧靖靜;胃癌組織中TRAIL、Survivin的表達及其體外誘導胃癌細胞凋亡的研究[D];鄭州大學;2005年

3 王海寬;木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶基因的克隆及在甲醇畢赤酵母中的表達[D];天津科技大學;2005年

4 Q，

本文編號：1370435