本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)人端粒酶基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建及其細(xì)胞特征分析　出處：《浙江大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 端粒酶是一種由RNA和蛋白質(zhì)兩種組份構(gòu)成的核糖核蛋白復(fù)合體,其中RNA組份是端粒酶復(fù)制時(shí)用的模板,蛋白質(zhì)組分主要是端粒酶催化亞單位,又叫做端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT),它的功能是利用RNA模板復(fù)制端粒的重復(fù)片段,延長端粒。端粒的長度和細(xì)胞分裂時(shí)端粒損失的速度決定了不表達(dá)端粒酶細(xì)胞的衰老和壽命,而在表達(dá)端粒酶的細(xì)胞中端粒酶能補(bǔ)充端粒長度,使細(xì)胞的生命延長甚至永生。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)在細(xì)胞移植,基因治療,組織工程方面有重要作用,但是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖能力弱,傳代能力差。延長骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生命周期能彌補(bǔ)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的不足,具有重要的實(shí)際意義。因此,本研究制備了表達(dá)hTERT基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒,在分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的基礎(chǔ)上,將hTERT基因?qū)牍撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞中,并傳代290代以上。在傳代過程中,對轉(zhuǎn)導(dǎo)hTERT基因的細(xì)胞進(jìn)行了功能和特性的分析。 目的:通過重組逆轉(zhuǎn)錄病毒技術(shù)體外轉(zhuǎn)導(dǎo)hTERT基因,建立過表達(dá)端粒酶的hMSCs,經(jīng)傳代培養(yǎng)觀察過表達(dá)端粒酶的hMSCs分裂和增殖能力以及細(xì)胞生命周期變化。闡明使用hTERT作為目的基因能否延長hMSCs的生命周期,并研究過表達(dá)端粒酶hMSCs的表面抗原,細(xì)胞核型特征與致瘤性,向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞方向分化的潛力以及細(xì)胞蛋白組學(xué)特征。為將來構(gòu)建適用于臨床的、有較長生命周期和有一定分化能力的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞打下理論基礎(chǔ)。 方法和結(jié)果:使用重組病毒技術(shù)構(gòu)建表達(dá)hTERT的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒,用該病毒感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并使用TRAP-PCR方法證實(shí)我們重建了細(xì)胞的端粒酶活性。我們將轉(zhuǎn)導(dǎo)了hTERT的細(xì)胞接種于免疫缺陷小鼠皮下,未見腫瘤形成。轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的軟瓊脂細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)陰性,表明轉(zhuǎn)導(dǎo)hTERT的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞未出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化,沒有成瘤作用。另外,轉(zhuǎn)導(dǎo)了hTERT的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在相應(yīng)誘導(dǎo)液的作用下,能夠向成骨細(xì)胞,軟骨細(xì)胞,脂肪細(xì)胞方向分化,證實(shí)了細(xì)胞的多向分化潛能。采用雙向凝膠電泳加基質(zhì)輔助的激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜方法(2DE-MALDI-TOF-MS)分析轉(zhuǎn)導(dǎo)hTERT與未轉(zhuǎn)導(dǎo)hTERT的hMSCs的蛋白組學(xué)差異,我們鑒定了100種蛋白點(diǎn),發(fā)現(xiàn)有20種蛋白質(zhì)有差異表達(dá)。 結(jié)論:使用表達(dá)hTERT的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠再建細(xì)胞的端粒酶活性,克服細(xì)胞的復(fù)制衰老,延伸了細(xì)胞生命周期。免疫缺陷小鼠皮下接種實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)導(dǎo)hTERT的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞沒有成瘤作用。在相應(yīng)誘導(dǎo)液的作用下,轉(zhuǎn)導(dǎo)hTERT的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠向成骨細(xì)胞,軟骨細(xì)胞,脂肪細(xì)胞方向分化。差異蛋白組學(xué)分析表明,在過表達(dá)端粒酶hMSCs中有11種蛋白表達(dá)明顯升高,有9種蛋白表達(dá)明顯下降。本文研究結(jié)果提示hTERT具有抗復(fù)制衰老、延伸細(xì)胞生命周期的生物學(xué)作用,轉(zhuǎn)導(dǎo)了hTERT的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有向多種細(xì)胞分化的潛能,在組織工程,細(xì)胞工程,和基因工程方面有很大的應(yīng)用前景。我們的結(jié)果為研究hTERT基因延長細(xì)胞生命周期的分子機(jī)制提供了重要的線索。
[Abstract]:Telomerase is a nuclear protein complex composed of two components of RNA and protein , wherein the RNA component is a template used in the replication of telomerase . It is called telomerase reverse transcriptase ( hTERT ) . Its function is to use RNA template to replicate telomeric repeat fragments . It has important practical significance . Objective : To investigate the expression of hTERT gene in vitro by recombinant retroviral technology , and to establish hMSCs expressing telomerase , and to investigate whether hMSCs can extend the life cycle of hMSCs . Methods and results : The recombinant retrovirus expressing hTERT was constructed by using recombinant virus technique . The telomerase activity of human bone marrow mesenchymal stem cells was confirmed by the method of TRAP - PCR . Conclusion : The bone marrow mesenchymal stem cells transduced with hTERT have the potential to differentiate into osteoblasts , chondrocytes and fat cells . The results suggest that hTERT has the potential of resisting replication and aging and extending the life cycle of cells . The results suggest that hTERT has the potential to differentiate into various cells , and it has great potential for the tissue engineering , cell engineering and gene engineering . Our results provide important clues for the study of the molecular mechanism of hTERT gene prolonging the life cycle of cells .

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 �？←�;楊廣笑;何光源;;蛋白質(zhì)組學(xué)分離檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J];武漢植物學(xué)研究;2006年03期

2 康熙雄,王雅杰,張錕;蛋白質(zhì)組學(xué)及其臨床應(yīng)用[J];診斷學(xué)理論與實(shí)踐;2004年05期

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