本文關(guān)鍵詞：重組人白蛋白融合干擾素在畢赤酵母中的表達(dá)及穩(wěn)定性研究　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2006年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的 用電轉(zhuǎn)化方法將線性化重組表達(dá)載體質(zhì)粒pPIC9K-HSA-IFNα-2b轉(zhuǎn)化整合入畢赤酵母宿主菌SMD1168，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)出具有生物活性的目的蛋白，并對轉(zhuǎn)化子表達(dá)條件及遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行初步研究。方法 提取重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-HSA-IFNα-2b，小量限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定，鑒定后的重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶Sal Ⅰ酶切線性化，純化經(jīng)單酶切線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒DNA并電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母菌(P．Pastoris)SMD1168。將陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定和Mut表型鑒定并用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)上清進(jìn)行Western-Blot鑒定，抗G418抗性鑒定及用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定融合干擾素的表達(dá)水平。Wish細(xì)胞-VSV病毒系統(tǒng)的細(xì)胞病變抑制法(CPE)測定表達(dá)蛋白的抗病毒活性及其效價(jià)。在搖瓶培養(yǎng)條件下，初步研究了甲醇誘導(dǎo)濃度及菌體誘導(dǎo)起始OD_(600)值兩因素對轉(zhuǎn)化子表達(dá)水平的影響。最后，對轉(zhuǎn)化子基因及表達(dá)水平的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行鑒定。結(jié)果 通過電轉(zhuǎn)化方法成功將酶切線性化重組表達(dá)質(zhì)粒DNA整合入宿主菌基因組，并在甲醇誘導(dǎo)條件下成功表達(dá)出具有生物學(xué)活性的目的蛋白。用酶聯(lián)免疫法(ELISA)及Wish細(xì)胞-VSV病毒系統(tǒng)對目的蛋白的表達(dá)水平及抗病毒活性進(jìn)行了測定，表達(dá)量和比活分別是300mg／L和1.1×10~7IU／mg。搖瓶條件下，通過對甲醇誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)起始OD_(600)值兩因素對轉(zhuǎn)化子表達(dá)水平的影響的初步研究，我們發(fā)現(xiàn)：在0.5％～4.0％的范圍，隨著甲醇誘導(dǎo)濃度的升高蛋白表達(dá)量也升高，在其他因素固定時(shí)，菌體誘導(dǎo)起始OD值在5～80的范圍內(nèi)，，隨著OD值的升高表達(dá)量反而下降。同時(shí)，整合入轉(zhuǎn)化子的基因還具有遺傳穩(wěn)定性。結(jié)論 酶切線性化重組表達(dá)質(zhì)粒DNA的成功整合入宿主菌基因組及目的蛋白的成功表達(dá)和基因的表達(dá)遺傳穩(wěn)定性研究為大規(guī)模的發(fā)酵罐表達(dá)提供了保證。搖瓶條件下對轉(zhuǎn)化子表達(dá)水平影響因素的研
[Abstract]:Objective to integrate the linearized recombinant expression vector pPIC9K-HSA-IFN 偽 -2b into Pichia pastoris SMD1168 by electroporation. Methanol induced expression of bioactive target protein. Methods Recombinant expression plasmid pPIC9K-HSA-IFN 偽 -2b was extracted and identified by restriction enzyme digestion. The identified recombinant plasmid was linearized by restriction endonuclease Sal 鈪

本文編號：1364414