本文關(guān)鍵詞：腸出血性大腸桿菌O157:H7 TccP蛋白表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備和應(yīng)用研究　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157:H7是一種重要的傳染性病原菌。自1975年首次被分離以來,世界各地包括中國都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行。EHEC O157:H7感染可致腹瀉、出血性結(jié)腸炎(HC)、溶血性尿毒綜合征(HUS)及血栓性血小板減少性紫癜(TTP)等疾病,嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。EHEC O157的感染因具有暴發(fā)流行趨勢、強烈的致病性與致死性和抗生素治療可加劇病情的危險性等特點,已成為全球性公共衛(wèi)生問題。目前對其感染仍缺乏有效的防治方法,研究證明抗生素可促使O157菌釋放致死性志賀毒素(Stx)從而使患者并發(fā)HUS的危險性增加,因此進(jìn)一步研究其致病機制以尋找新的有效的防治方法具有重要義。 病原體和宿主的相互作用是決定感染及發(fā)病的關(guān)鍵。EHEC與宿主腸道粘膜上皮細(xì)胞的粘附是疾病發(fā)展的第一步。介導(dǎo)O157細(xì)菌粘附定植的主要結(jié)構(gòu)單元是Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TTSS)。該菌通過TTSS將其轉(zhuǎn)位緊密粘附素受體(Tir)和Tir-細(xì)胞骨架偶聯(lián)蛋白(TccP)等效應(yīng)毒力分子轉(zhuǎn)運至宿主細(xì)胞,經(jīng)一系列的信號傳導(dǎo)過程介導(dǎo)與宿主細(xì)胞的“粘附與擦拭”(A/E)損傷。TccP是最近發(fā)現(xiàn)并確定的一種新的O157:H7毒力因子,是O157轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞的效應(yīng)分子中與宿主細(xì)胞分子N-Wiskott Aldrich綜合癥蛋白(N-WASP)相互作用的終端效應(yīng)分子,由O157:H7基因組內(nèi)編號為Z3072的開放閱讀框序列編碼,是一個富含脯氨酸的蛋白,為O157粘附宿主細(xì)胞、形成肌動蛋白踏板、造成A/E損傷所必需。本課題采用基因工程的方法對腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157:H7 TccP蛋白進(jìn)行了克隆表達(dá)、純化,進(jìn)而在此基礎(chǔ)上制備了高滴度和高特異性的兔抗TccP多克隆抗體并對其應(yīng)用進(jìn)行了實驗研究。 首先選擇EHEC O157:H7 Sakai菌株基因組為模板,采用PCR及序列測定等方法獲得EHEC O157:H7 tccP DNA,克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+),轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá);對在C末端融合了6his純化標(biāo)簽的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blotting法分析;使用Ni2+-NTA離子換樹脂進(jìn)行蛋白純化;純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE純度分析。實驗結(jié)果顯示:成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-tccP;Western blotting結(jié)果表明,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌中表達(dá)了分子量為37kD左右的目的蛋白;表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-NTA離子交換樹脂純化,TccP-6his融合蛋白純度為95%以上。 以純化TccP-6his融合蛋白免疫新西蘭大白兔,成功制備了有較高滴度和特異性的兔抗TccP多克隆抗體。以所獲特異性多克隆抗體作為一抗,使用雙向免疫擴散、ELISA、Western blotting和免疫熒光等方法檢測標(biāo)本中TccP蛋白。結(jié)果顯示:免疫擴散檢測可見兔抗TccP多克隆抗體稀釋度為1:32時,仍呈現(xiàn)明顯沉淀線;ELISA檢測結(jié)果抗體滴度為1:640 000;Western blotting檢測表明:用兔抗TccP多克隆抗體與TccP抗原進(jìn)行免疫印跡,在分子量約37kD處有一特異性條帶,與陽性對照純化TccP-6his融合蛋白相一致;細(xì)胞免疫熒光檢測顯示,在被O157細(xì)菌粘附的HeLa細(xì)胞部位可見綠色熒光,其分布與細(xì)菌粘附的部位一致。提示:所制備的兔抗TccP多克隆抗體與粘附至HeLa細(xì)胞的O157細(xì)菌發(fā)生抗原抗體反應(yīng),重組的TccP表現(xiàn)有與天然細(xì)菌分泌的TccP相同的免疫原性。 在本課題實驗研究中,我們從EHEC O157:H7 Sakai菌株的基因組中克隆得到了O157 tccP DNA序列,該序列與GenBank報道的序列完全一致;所構(gòu)建的TccP原核表達(dá)載體在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá),經(jīng)純化后得到了高純度TccP-6his融合蛋白。以傳統(tǒng)的多克隆抗體技術(shù)制備了兔抗TccP多克隆抗體。該多克隆抗體可用于對EHEC O157:H7中TccP蛋白進(jìn)行特異性檢測,適用于雙向免疫擴散、ELISA、Western blotting和免疫熒光等多種常規(guī)檢測方法。利用掃描電鏡觀察了O157體外粘附細(xì)胞模型,結(jié)果顯示O157與HeLa細(xì)胞緊密粘附,呈典型的局灶性粘附(LA)。使用兔抗TccP多克隆抗體對EHEC O157:H7粘附宿主細(xì)胞模型內(nèi)的TccP蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位研究,結(jié)果直觀地顯示了TccP被聚集在宿主細(xì)胞被EHEC O157:H7粘附處細(xì)胞膜的下方。tccP基因的克隆表達(dá)、純化,TccP蛋白的獲得以及特異性兔抗TccP多克隆抗體的制備及應(yīng)用成功,為后續(xù)進(jìn)一步研究TccP在O157致病機制中的作用奠定了堅實的基礎(chǔ)。目前國內(nèi)未見類似研究報道,故本研究具有一定的創(chuàng)新性。此課題已獲國家自然科學(xué)基金資助項目(30670107),后續(xù)相關(guān)研究正在進(jìn)行中。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 李升團,韓光紅;大腸桿菌O157:H7感染的病原學(xué)與流行病學(xué)[J];解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;1997年05期

2 倪大新,汪華,顧玲,郭喜玲,莊菱,施平,潘浩,史智揚,胡曉抒,劉光中;江蘇省1999年大腸埃希菌O157∶H7宿主動物帶菌情況調(diào)查[J];中華流行病學(xué)雜志;2002年02期

3 李洪衛(wèi),景懷琦,逄波,趙廣法,楊晉川,徐建國;徐州市2000年腸出血性大腸埃希菌O157∶H7感染性腹瀉的調(diào)查[J];中華流行病學(xué)雜志;2002年02期

4 汪華,景懷琦,李紅衛(wèi),倪大新,趙廣法,顧玲,楊晉川,史智揚,劉光中,胡曉抒,徐建國;江蘇省淮北地區(qū)腸出血性大腸埃希菌O157:H7感染性腹瀉并發(fā)急性腎衰的研究[J];中華流行病學(xué)雜志;2004年11期

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本文編號：1353877