本文關(guān)鍵詞：丹毒絲菌表面保護(hù)抗原A作為重組亞單位疫苗和核酸疫苗的初步研究　出處：《新疆大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： [背景及目的]丹毒絲菌是豬丹毒和人類類丹毒癥的致病菌,能夠引起豬的急性或亞急性敗血癥和慢性的關(guān)節(jié)炎及心內(nèi)膜炎,對其它許多家禽家畜也存在一定的危害,這給許多國家和地區(qū)的養(yǎng)殖業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失,同時也對人類的健康構(gòu)成一定的威脅。目前,盡管丹毒絲菌活菌疫苗、滅活疫苗和抗菌血清已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于預(yù)防和治療該菌引發(fā)的疾病,并在很大程度上能夠避免急性豬丹毒的流行,但是它們的有效性通常依賴于動物對該疫苗的易感性,而母源抗體的存在使仔豬對現(xiàn)行活疫苗不敏感,最新研究也顯示這類疫苗在預(yù)防慢性的豬丹毒方面效果并不理想,且在很大程度上增加了豬慢性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率,加上這些疫苗本身存在一定的變異性,所以開發(fā)新一代的高效、廉價、安全的疫苗顯得尤為必要。本研究旨在利用分子生物學(xué)技術(shù),以丹毒絲菌spaA(surface protective antigen A)基因為候選基因探索開發(fā)新一代的預(yù)防由該菌引起的疾病的亞單位疫苗和核酸疫苗。 [方法]通過PCR方法從丹毒絲菌新疆分離株1249(xj-1249)基因組擴(kuò)增spaA基因N端免疫保護(hù)區(qū)片段(spaA-N)并在原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中對該片段進(jìn)行表達(dá),通過GST Bind Resin純化得到重組表達(dá)蛋白r-SpaA-N,用該重組蛋白在第0天、14天、28天對小鼠各皮下免疫一次,同時檢測體內(nèi)抗體水平變化情況,在小鼠末次免疫結(jié)束兩周后分別對免疫組和對照組小鼠攻毒,菌量約為1.5×10~5,觀察各組小鼠的攻毒結(jié)果并比較攻毒死亡小鼠和正常小鼠解剖后臟器之間的區(qū)別。另一方面,將擴(kuò)增的丹毒絲菌的spaA基因構(gòu)建到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+),得到重組真核質(zhì)粒pcDNA3-spaA,經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后通過RT-PCR方法確定該質(zhì)粒在真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá),再用100μg的重組質(zhì)粒pcDNA3-spaA和1%的鹽酸左旋咪唑混合肌肉免疫昆明白小鼠,對照組免疫pcDNA3.1空載,檢測該質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)的免疫效果。 [結(jié)果] (1)亞單位疫苗的研究:重組蛋白r-SpaA-N免疫組的攻毒實驗顯示所有小鼠都能夠有效預(yù)防丹毒絲菌強(qiáng)毒株對小鼠的侵染,GST免疫組和生理鹽水免疫組小鼠在腹腔注射丹毒絲菌后全部死亡,通過Western Blot和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)在r-SpaA-N免疫組小鼠體內(nèi)檢測到抗SpaA-N的抗體,且抗體滴度高達(dá)1:150,000;(2)核酸疫苗的研究:成功構(gòu)建得到針對丹毒絲菌的核酸疫苗pcDNA3-spaA,體外轉(zhuǎn)染試驗顯示該質(zhì)粒能夠在mRNA水平表達(dá),但對小鼠肌肉免疫該質(zhì)粒后在體內(nèi)檢測不到針對SpaA蛋白的抗體。 [結(jié)論]原核表達(dá)的重組蛋白r-SpaA-N能夠有效預(yù)防丹毒絲菌對小鼠的侵染,這顯示了其在疫苗開發(fā)方面的潛在優(yōu)勢;構(gòu)建的核酸疫苗pcDNA3-spaA只能在體外mRNA水平表達(dá),卻不能有效激發(fā)體內(nèi)免疫反應(yīng),尚需進(jìn)一步改善。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：新疆大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1354050