發(fā)布時(shí)間：2017-12-27 20:14

  本文關(guān)鍵詞：Cdc42參與爪蟾卵母細(xì)胞胞質(zhì)分裂過程　出處：《中國醫(yī)科大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 前言 卵母細(xì)胞成熟受多種途徑精密調(diào)控，調(diào)控信號的變化對于卵母細(xì)胞成熟中胚泡(germinal vesicle，GV)期和胚泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD)以及胞質(zhì)分裂后極體釋放的有序進(jìn)行起關(guān)鍵作用。卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的過程伴隨細(xì)胞極化，中期Ⅰ紡錘體的一端在特定的空間與時(shí)間上接觸卵母細(xì)胞皮質(zhì)層對誘發(fā)下游事件至關(guān)重要，如分裂溝的定位、分裂環(huán)的形成、胞質(zhì)分裂和極體釋放。此過程需要肌動(dòng)蛋白細(xì)絲，肌球蛋白等細(xì)胞骨架物質(zhì)的參與，但是什么樣的信號促使紡錘體精確地遷移到特定的皮質(zhì)層區(qū)域而促發(fā)上述事件的發(fā)生困擾了生物學(xué)家很多年。本研究發(fā)現(xiàn)，Cdc42，一種細(xì)胞骨架和細(xì)胞極化的重要調(diào)節(jié)物，在減數(shù)分裂和卵母細(xì)胞成熟過程中有重要的作用。 Cdc42首次在Saccharomyces cerevisiae中發(fā)現(xiàn)，作為小G蛋白R(shí)ho家族一類能結(jié)合GTP的蛋白質(zhì)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中發(fā)揮著“分子開關(guān)”樣的重要作用。最初發(fā)現(xiàn)Cdc42參與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)，通過對酵母基因組的研究表明，Cdc42在細(xì)胞極化，特別是在S．cerevisiae芽位點(diǎn)的建立上發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究人員發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中顯微注射活化態(tài)的Cdc42，誘導(dǎo)偽足的形成。多項(xiàng)研究證明，Cdc42調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移，胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸以及細(xì)胞發(fā)育。Cdc42通過actin等細(xì)胞骨架物質(zhì)來調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。分子生理學(xué)研究已經(jīng)證明Cdc42與一些formin、Par3/Par6/aPKC細(xì)胞極化復(fù)合物分子結(jié)合，細(xì)胞分裂前紡錘體的不對稱定位需要formin參與，并且Par3/Par6/aPKC在紡錘體遷移后，不對稱地定位在卵母細(xì)胞中。是否Cdc42與formin、Par3/Par6/aPKC一起參與細(xì)胞的極化分裂過程?有研究表明在酵母中(Saccharomyces cerevisiae)，Cdc42和Bnilp共同參與紡錘體的定位。本研究以另一不對稱分裂細(xì)胞爪蟾卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中極體的形成過程為模型，研究是否Cdc42在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中極體形成以及胞質(zhì)分裂中發(fā)揮作用并探討其在生物進(jìn)化過程中細(xì)胞分裂中可能具有的普遍性。 實(shí)驗(yàn)材料 1、基因克隆相關(guān)質(zhì)粒及蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)試劑 2、熒光標(biāo)記的相關(guān)分子生物學(xué)試劑 實(shí)驗(yàn)方法 一、爪蟾卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備及裂解 實(shí)驗(yàn)前3日將雌性成熟爪蟾皮下注射50IU孕馬血清促性腺激素(serumgonadotrophin，PMSG)，實(shí)驗(yàn)當(dāng)日斷頭處死爪蟾，取腹腔兩側(cè)卵巢組織，在顯微鏡下將其撕裂成10～15個(gè)卵左右的碎片，以膠原酶(1mg/mL)消化3小時(shí)，取大小相似發(fā)育成熟Ⅵ期卵母細(xì)胞，置于無Ca~(2+)1×OR2培養(yǎng)液中，室溫震蕩培養(yǎng)4h。冷裂解緩沖液(EB緩沖液：20mM pH 7.3 HEPES，80mM磷酸甘油，20mMEGTA，15mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇，10μM ATP，，150mM NaF，10μg/mL抑(蛋白)酶醛肽，200μM苯甲磺酰氟，25μg/mL苯甲脒)10μL裂解卵母細(xì)胞，4℃13000g離心5min，上清液與2×SDS樣品緩沖液和β-巰基乙醇混合，-20℃貯存。 二、爪蟾卵母細(xì)胞MPF激酶活性檢測 MPF激酶活性測定：1μM孕酮刺激卵母細(xì)胞，取不同時(shí)間點(diǎn)的卵母細(xì)胞進(jìn)行裂解，8μl卵母細(xì)胞上清裂解液加4μl EB緩沖液(含有2μg histone H1、5μCi[~(32)P]γ-ATP和100μM ATP)，室溫反應(yīng)20min，12μL 2X SDS樣品緩沖液終止反應(yīng)，15％SDS-PAGE電泳，放射自顯影觀察。 三、體外合成Cdc42T17N、GFP-WGBD mRNA 將Cdc42T17N、GFP-wGBD質(zhì)粒用BamH1進(jìn)行酶切線性化，1.0％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，以線性化DNA為模板，合成Cdc42T17N、GFP-wGBD mRNA，-70℃保存?zhèn)溆谩?四、正常爪蟾卵母細(xì)胞胞質(zhì)分裂過程觀察 在無Ca~(2+)1×OR2培養(yǎng)液中，14nL Alexa-phalloidin(4U/ml)和10nL Rhodamine-tubulin(3mg/ml)共同顯微注射爪蟾卵母細(xì)胞。注射后8小時(shí)，用1μM孕酮20℃條件下刺激卵母細(xì)胞，以動(dòng)物極出現(xiàn)白點(diǎn)來判斷卵母細(xì)胞是否發(fā)生胚泡破裂(germinal yesicle breakdown，GVBD)。GVBD發(fā)生90分鐘后，采用共聚焦顯微鏡觀察卵母細(xì)胞胞質(zhì)分裂過程，放大倍數(shù)40×，掃描間隙2μm，時(shí)間間隔72sec，時(shí)間延遲攝影法(time-lapse)觀察。 五、觀察爪蟾卵母細(xì)胞中染色體變化 按GVBD發(fā)生時(shí)間收集卵母細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到新鮮配置的1×OR2培養(yǎng)液中。GVBD發(fā)生后60min，將單個(gè)卵母細(xì)胞放置在含有Hoechst染料(1：5000)的溶液中。染色20min后，自動(dòng)照相熒光顯微鏡TIME-LAPES法觀察此期間Cdc42T17N mRNA注射組及對照組卵母細(xì)胞染色體的變化。 六、Cdc42T17N mRNA注射組及對照組爪蟾卵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 14nL Alexa-phalloidin(4U/ml)和10nL Rhodamine-tubulin(3mg/ml)共同顯微注射入爪蟾卵母細(xì)胞。注射后8小時(shí)，用孕酮20℃條件下刺激卵母細(xì)胞，GVBD發(fā)生90分鐘后，TIME-LAPES法觀察此期間Cdc42T17N mRNA注射組及對照組卵母細(xì)胞收縮環(huán)的形成過程。 七、Cdc42T17N mRNA注射組及對照組爪蟾卵母細(xì)胞質(zhì)分裂過程中Cdc42活性觀察 用10nL 0.25mgml GFP-wGBD mRNA和10nL Rhodamine-tubulin(3mg/ml)共同注射爪蟾卵母細(xì)胞，室溫表達(dá)8h后，16℃孕酮溶液孵育過夜，在此條件下，部分卵母細(xì)胞經(jīng)歷GVBD，但是還未裝配形成MⅠ紡錘體。利用共聚焦顯微鏡觀察Cdc42T17N mRNA注射組及對照組卵母細(xì)胞，掃描間隙2μm，時(shí)間間隔2min，進(jìn)行TIME-LAPES實(shí)驗(yàn)。 八、Cdc42和球形actin在爪蟾卵母細(xì)胞胞質(zhì)分裂中的定位分析 收縮環(huán)形成觀察：14nL Alexa-g-actin(4U/ml)和10nL Rhodamine-tubulin(3mg/ml)共同顯微注射爪蟾卵母細(xì)胞。用孕酮室溫條件下刺激卵母細(xì)胞，GVBD發(fā)生90分鐘后，TIME-LAPSE法觀察此期間卵母細(xì)胞收縮環(huán)形成。 共定位觀察：10nL GFP-wGBD mRNA(0.25mg/ml)和14nL Alexa-g-actin(4U/ml)共同注射爪蟾卵母細(xì)胞，方法同Cdc42活性觀察。 九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 比較正常卵母細(xì)胞、Cdc42T17N mRNA注射組的卵母細(xì)胞胞質(zhì)分裂和極體形成百分率，采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 一、爪蟾卵母細(xì)胞MPF激酶活性 MPF在孕酮刺激后2h GV期處于失活狀態(tài)，3h時(shí)活性增強(qiáng)，GVBD后，MPF活性又處于較低水平。 二、正常爪蟾卵母細(xì)胞胞質(zhì)分裂過程觀察 Alexa-phalloidin和Rhodamine-tubuIin共同顯微注射爪蟾卵母細(xì)胞，時(shí)間延遲攝影法實(shí)時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)：隨卵母細(xì)胞成熟進(jìn)程，在紡錘體(spindle)一端與卵母細(xì)胞皮質(zhì)層接觸后，纖維型actin(F-actin)逐漸聚集在紡錘體上方和周邊，形成收縮環(huán)(contractile ring)，收縮環(huán)逐漸向內(nèi)向下移動(dòng)，切斷紡錘體，形成極體(polar body)，胞質(zhì)分裂完成。 三、熒光顯微鏡觀察DNA染色結(jié)果 卵母細(xì)胞GVBD 60min后以Hoechst染料對DNA染色后TIME-LAPSE實(shí)驗(yàn)可見：對照組卵母細(xì)胞形成極體：Cdc42T17N mRNA注射組未見極體形成。 四、Cdc42T17N mRNA注射組爪蟾卵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 標(biāo)記Alexa-phalloidin和Rhodamine-tubulin顯微注射入爪蟾卵母細(xì)胞。通過time-lapse實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：對照組卵母細(xì)胞中，隨著卵母細(xì)胞成熟分裂進(jìn)行，F(xiàn)-actin逐漸聚集于紡錘體的上方并形成收縮環(huán)(contractile ring)，并最終切斷紡錘體形成極體；Cdc42T17N mRNA注射組見少量F-actin聚集，可見紡錘體拉長又再解聚，未見收縮環(huán)和極體形成，未見胞質(zhì)分裂發(fā)生。 五、Cdc42T17N mRNA注射組及對照組爪蟾卵母細(xì)胞胞質(zhì)分裂過程中Cdc42活性觀察 GFP-wGBD探針可觀察卵母細(xì)胞內(nèi)Cdc42活性變化。在GV和GVBD發(fā)生后，未觀察到Cdc42活性出現(xiàn)。在極體釋放的數(shù)分鐘前，紡錘體的微管上方可見微弱的Cdc42活性，2～4min內(nèi)，活性逐漸增強(qiáng)，隨后細(xì)胞分裂收縮環(huán)形成，胞質(zhì)分裂發(fā)生�；钚缘腃dc42向下擴(kuò)展，包繞整個(gè)極體。Cdc42T17N mRNA注射組未見明顯的Cdc42活性出現(xiàn)，但可見紡錘體的形態(tài)發(fā)生與對照組相似的變化，最終未形成極體。 六、Cdc42和g-actin在爪蟾卵母細(xì)胞胞質(zhì)分裂中的定位分析 Alexa-g-actin和Rhodamine-tubulin共同顯微注射爪蟾卵母細(xì)胞。通過time-lapse實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：g-actin逐漸聚集于紡錘體上方并形成收縮環(huán)，最終切斷紡錘體，極體形成。 Alexa-g-actin和GFP-wGBD mRNA共同顯微注射后可見在卵母細(xì)胞的胞質(zhì)分裂過程中，Cdc42活性和g-actin存在明顯的共同定位現(xiàn)象，在出現(xiàn)的時(shí)間上具有一致性。 七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正常卵母細(xì)胞、Cdc42T17N mRNA注射組的卵母細(xì)胞胞質(zhì)分裂和極體形成百分率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，Cdc42T17N mRNA注射組的卵母細(xì)胞胞質(zhì)分裂和極體形成百分率與正常對照組卵母細(xì)胞相比明顯降低。 結(jié)論 1、在爪蟾卵母細(xì)胞GV期，MPF處于失活狀態(tài)，GVBD發(fā)生時(shí)活性增強(qiáng)，收縮環(huán)形成前，MPF活性又處于較低水平。 2、與對照組相比，注射了Cdc42T17N mRNA的爪蟾卵母細(xì)胞GV和GVBD未見明顯形態(tài)學(xué)變化，孕酮誘導(dǎo)的GVBD也未見明顯異常。 3、與對照組相比，注射了Cdc42T17N mRNA的爪蟾卵母細(xì)胞胞質(zhì)分裂和極體形成受到抑制。 4、與對照組相比，注射了Cdc42T17N mRNA的爪蟾卵母細(xì)胞染色體的復(fù)制、分離并未受到影響。 5、Cdc42活性和g-actin存在明顯的共同定位現(xiàn)象，在出現(xiàn)的時(shí)間上具有一致性。
[Abstract]:Preface
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R321

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉雄，閻隆飛;植物肌動(dòng)蛋白研究的過去及現(xiàn)狀[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1994年03期

本文編號：1343035