本文關(guān)鍵詞：梅毒螺旋體TpN17重組抗原的表達(dá)、純化及鑒定　出處：《昆明理工大學(xué)》2006年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)引起的一種危害性極大的全世界流行的性傳播疾病。血清學(xué)試驗(yàn)以其快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)在臨床檢測(cè)中得到廣泛的應(yīng)用,但是,目前的檢測(cè)方法依然存在著靈敏性差、假陽(yáng)性率高、抗原來(lái)源相對(duì)匱乏等缺點(diǎn),而采用基因工程抗原代替天然抗原建立的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)在血清學(xué)檢測(cè)中顯示了良好的應(yīng)用前景。本研究旨在通過(guò)基因工程技術(shù)制備梅毒螺旋體TpN17重組脂蛋白抗原,為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)臨床檢測(cè)效果更好的新型梅毒酶聯(lián)免疫診斷試劑盒提供實(shí)驗(yàn)材料。 首先,我們通過(guò)PCR的方法從Tp基因組中擴(kuò)增編碼TpN17成熟肽的目的基因片段,經(jīng)HindⅢ和EcoRI雙酶切后,定向克隆至pET-28b(+)中,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28b(+)/tpn17,轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中,通過(guò)菌體PCR、酶切反應(yīng)及進(jìn)一步測(cè)序篩選獲得了工程菌株BL21/pET-28b(+)/tpn17。工程菌經(jīng)37℃培養(yǎng),1.0mmol/L IPTG誘導(dǎo)4h后可獲得高表達(dá)量的重組蛋白,SDS-PAGE分析顯示其分子量約為19kD,與His-TpN17融合蛋白理論分子量值(18.7kD)相符,凝膠掃描分析表明誘導(dǎo)后目的蛋白His-TpN17產(chǎn)量約為菌體蛋白總量的31%。 進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),His-TpN17重組蛋白主要以可溶性形式存在于大腸桿菌胞內(nèi)。純化過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn),反復(fù)凍融加溶菌酶破碎方法的聯(lián)合采用以及對(duì)破碎后菌體沉淀進(jìn)行多次洗滌等改進(jìn)方案可以使目的蛋白更多地釋放到可溶性上清粗提液中,經(jīng)Ni~(2+)螯合層析純化后,重組蛋白的SDS-PAGE僅在約19kD處顯示單一蛋白條帶,掃描分析其純度在95%以上,Western-blot進(jìn)一步證實(shí)該條帶確為His-TpN17蛋白純化后產(chǎn)物,并且該重組抗原與二期梅毒血清發(fā)生了很強(qiáng)的免疫反應(yīng)。
[Abstract]:Syphilis is a worldwide epidemic of sexually transmitted diseases, which are caused by Treponema pallidum (Tp). Serological test for the rapid, simple and economical advantages in clinical detection has been widely used. However, the current detection methods still exist in sensitivity, high false positive rate, the relative lack of source of antigen and other shortcomings, and the use of genetically engineered antigen instead of natural antigen based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in serum detection showed a good application prospect. The aim of this study is to prepare TpN17 recombinant lipoprotein antigen from Treponema pallidum by genetic engineering technology, and provide experimental materials for further research and development of new syphilis ELISA diagnostic kit.
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 戴慧光;聚合酶鏈反應(yīng)在梅毒診斷中的應(yīng)用[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).皮膚性病學(xué)分冊(cè);1996年01期

2 尹躍平;重組梅毒螺旋體抗原的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(皮膚性病學(xué)分冊(cè));1999年06期

3 宋曉國(guó),凌世淦,張賀秋,馬賢凱,陳坤,朱翠俠,邱艷;重組梅毒螺旋體表位抗原及多表位嵌合抗原研究[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2002年01期

4 黨倩麗,馮捷,張小艷,陸學(xué)東,劉超,牛新武;梅毒螺旋體特異性抗體對(duì)梅毒早期診斷和治療的評(píng)價(jià)[J];臨床皮膚科雜志;2005年02期

5 朱慧蘭,徐廣坤,武明昌,葉興東,費(fèi)實(shí),吳德標(biāo);多功能顯微診斷儀在I期梅毒診斷中臨床價(jià)值的初步評(píng)價(jià)[J];中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志;2001年01期

6 于柏峰,林永前,劉冰;四種梅毒血清學(xué)檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)[J];中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué);2003年06期

7 張賀秋,陳坤,宋曉國(guó),王國(guó)華,凌世淦,邱燕,馬賢凱;重組表達(dá)梅毒螺旋體抗原血清反應(yīng)性研究[J];現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2004年05期

8 龔匡隆,尤永燕,邵長(zhǎng)庚;梅毒血清學(xué)試驗(yàn)的內(nèi)部質(zhì)量控制[J];中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志;1997年01期

9 黨倩麗,陸學(xué)東,張小艷,楊來(lái)智;梅毒螺旋體感染兔模型中特異性抗體分析[J];中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志;2004年01期

10 杜蘭英,莊輝,何君,周育森,黃策;梅毒螺旋體重組抗原TmpA的表達(dá)及其在梅毒診斷中的應(yīng)用[J];中華傳染病雜志;2001年03期

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本文編號(hào)：1342062