本文關鍵詞：梅毒螺旋體TpN17重組抗原的表達、純化及鑒定　出處：《昆明理工大學》2006年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)引起的一種危害性極大的全世界流行的性傳播疾病。血清學試驗以其快速、簡便、經(jīng)濟等優(yōu)點在臨床檢測中得到廣泛的應用,但是,目前的檢測方法依然存在著靈敏性差、假陽性率高、抗原來源相對匱乏等缺點,而采用基因工程抗原代替天然抗原建立的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)在血清學檢測中顯示了良好的應用前景。本研究旨在通過基因工程技術制備梅毒螺旋體TpN17重組脂蛋白抗原,為進一步研究開發(fā)臨床檢測效果更好的新型梅毒酶聯(lián)免疫診斷試劑盒提供實驗材料。 首先,我們通過PCR的方法從Tp基因組中擴增編碼TpN17成熟肽的目的基因片段,經(jīng)HindⅢ和EcoRI雙酶切后,定向克隆至pET-28b(+)中,構建原核表達載體pET-28b(+)/tpn17,轉化至E.coli BL21(DE3)中,通過菌體PCR、酶切反應及進一步測序篩選獲得了工程菌株BL21/pET-28b(+)/tpn17。工程菌經(jīng)37℃培養(yǎng),1.0mmol/L IPTG誘導4h后可獲得高表達量的重組蛋白,SDS-PAGE分析顯示其分子量約為19kD,與His-TpN17融合蛋白理論分子量值(18.7kD)相符,凝膠掃描分析表明誘導后目的蛋白His-TpN17產(chǎn)量約為菌體蛋白總量的31%。 進一步的研究發(fā)現(xiàn),His-TpN17重組蛋白主要以可溶性形式存在于大腸桿菌胞內。純化過程中我們發(fā)現(xiàn),反復凍融加溶菌酶破碎方法的聯(lián)合采用以及對破碎后菌體沉淀進行多次洗滌等改進方案可以使目的蛋白更多地釋放到可溶性上清粗提液中,經(jīng)Ni~(2+)螯合層析純化后,重組蛋白的SDS-PAGE僅在約19kD處顯示單一蛋白條帶,掃描分析其純度在95%以上,Western-blot進一步證實該條帶確為His-TpN17蛋白純化后產(chǎn)物,并且該重組抗原與二期梅毒血清發(fā)生了很強的免疫反應。
[Abstract]:Syphilis is a worldwide epidemic of sexually transmitted diseases, which are caused by Treponema pallidum (Tp). Serological test for the rapid, simple and economical advantages in clinical detection has been widely used. However, the current detection methods still exist in sensitivity, high false positive rate, the relative lack of source of antigen and other shortcomings, and the use of genetically engineered antigen instead of natural antigen based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in serum detection showed a good application prospect. The aim of this study is to prepare TpN17 recombinant lipoprotein antigen from Treponema pallidum by genetic engineering technology, and provide experimental materials for further research and development of new syphilis ELISA diagnostic kit.
【學位授予單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1342062