本文關(guān)鍵詞：骨髓間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)1-甲基4-苯基吡啶離子誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用　出處：《中國(guó)醫(yī)科大學(xué)》2007年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】： 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)1-甲基4苯基吡啶離子誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用 目的 近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)或稱(chēng)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有干細(xì)胞特性，有多向分化的潛能，MSCs取材容易，在體外容易培養(yǎng)和增殖，自體MSCs移植又避免了免疫排斥反應(yīng)。因而骨髓間質(zhì)干細(xì)胞用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及其損傷修復(fù)的細(xì)胞學(xué)治療基礎(chǔ)，具有廣闊的應(yīng)用前景。帕金森病(Parkinson disease，PD)是一種慢性進(jìn)展性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，主要病理特征是黑質(zhì)紋狀體的多巴胺能(DA)神經(jīng)元發(fā)生退行性變，形態(tài)學(xué)研究表明PD病人腦內(nèi)DA能神經(jīng)元呈凋亡樣改變，提示細(xì)胞凋亡可能參與了PD的發(fā)病過(guò)程。1-甲基4-苯基吡啶離子(1-methyl4-phenyl pyridium，MPP~+)能選擇性地?fù)p害黑質(zhì)DA能神經(jīng)元。PC12細(xì)胞為大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，其所含的受體及遞質(zhì)與黑質(zhì)DA能神經(jīng)元相似，能與原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞說(shuō)明一致的問(wèn)題，所以MPP~+制備的PC12細(xì)胞模型常作為研究PD的細(xì)胞模型。MSCs對(duì)DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用考慮與其能分泌的細(xì)胞因子有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)、純化MSCs并收集其條件培養(yǎng)液，檢測(cè)其分泌的對(duì)DA能神經(jīng)元有保護(hù)作用的細(xì)胞因子(GDNF、BDNF、IL-6)，通過(guò)評(píng)價(jià)MSCs分泌物對(duì)MPP~+制備的PC12細(xì)胞的c-Jun、bcl2和caspase3的影響，初步探討MSCs分泌物對(duì)MPP~+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。 方法 1、原代骨髓間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液的收集和濃縮 2、MSCs細(xì)胞表面抗原測(cè)定(免疫熒光檢測(cè)) 一抗為CD44及CD45，二抗為CY3。 3、MSCs分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子GDNF、BDNF、IL-6蛋白水平測(cè)定(ELISA法測(cè)定) 4、PC12細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理 實(shí)驗(yàn)分組為：①空白對(duì)照組，在細(xì)胞培養(yǎng)體系中不加入任何藥物；②MSCs上清液處理組，細(xì)胞接種后24h在細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入MSCs上清液，MSCs上清液30μl、60μl、120μl，并用5％FBS／RPMI1640將終體積補(bǔ)足至300ul，使MSCs上清液體積分?jǐn)?shù)分別為10％、20％、40％。③MPP~+處理組，細(xì)胞接種后24h在細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入MPP~+，終濃度為100μmol·L-1，200μmol·L-1，400μmol·L-1；④聯(lián)合組，接種后24h在細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入200μmol／L MPP~+，24h后再分別給予MSCs上清液30，60，，120μL。各組細(xì)胞給藥后24和48h進(jìn)行下列指標(biāo)的檢測(cè)。 5、細(xì)胞活力測(cè)定(MTT法) 6、透射電鏡觀(guān)察PC12細(xì)胞凋亡 7、PI染色流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡 8、bcl2、TH、c-Jun、caspase3蛋白的檢測(cè)(免疫細(xì)胞化學(xué)法) 9、bcl2、c-Jun、caspase3、THmRNA的檢測(cè)(RT-PCR法) 細(xì)胞給予MSCs上清液和MPP~+處理后不同時(shí)間點(diǎn)用Trizol提取細(xì)胞的總RNA，RT反應(yīng)結(jié)束后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后每組目的基因各耳義5μL，NADPH取相同體積于1.5％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，用凝膠圖像分析儀分析，根據(jù)目的基因與內(nèi)參照基因電泳條帶密度的比值，進(jìn)行bcl2、c-Jun、caspase3和THmRNA表達(dá)水平的半定量分析。 結(jié)果 1、MSCs可在體外分離擴(kuò)增，其表面抗原CD44陽(yáng)性而CD45陰性 貼壁細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，為單個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞的克隆，細(xì)胞形態(tài)均一。培養(yǎng)2～5d為生長(zhǎng)潛伏期，細(xì)胞增殖較慢，細(xì)胞數(shù)變化不明顯。6～12d為細(xì)胞快速增殖期，排列有一定方向性，呈旋渦樣生長(zhǎng)。培養(yǎng)15～18d，細(xì)胞出現(xiàn)80％～90％的融合，克隆間出現(xiàn)重疊，無(wú)接觸抑制現(xiàn)象發(fā)生。胰酶消化傳代的細(xì)胞于12h內(nèi)完全貼壁、伸展并重新變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，保持原代細(xì)胞形態(tài)，生長(zhǎng)迅速，7～10d達(dá)到完全融合。MSCs表面抗原的鑒定通過(guò)免疫熒光檢測(cè)顯示，CD45表達(dá)為陰性，證明其為非造血類(lèi)細(xì)胞；CD44表達(dá)陽(yáng)性，證明其為干細(xì)胞類(lèi)細(xì)胞(圖一A，B，C，D)。 2、MSCs培養(yǎng)上清中能分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子GDNF、BDNF、IL-6(表1) 3、MTT法MSCs上清液可以抵抗MPP~+對(duì)PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，提高細(xì)胞生存率 MPP~+的終濃度為lOOμmol·L-1，200μmol·L-1，400μmol·L-1孵育24h后，細(xì)胞活力與對(duì)照組相比(對(duì)照組設(shè)為1)分別降低至0.76±0.06、0.47±0.02、0.34±0.01；孵育48h后，細(xì)胞活力與對(duì)照組相比(對(duì)照組設(shè)為1)分別降低至0.61±0.01、0.30±0.04、0.20±0.04，隨著MPP~+濃度的增加，PC12細(xì)胞活力逐漸下降，且相鄰濃度間比較有顯著性差異(P＜0.05)。在相同MPP~+濃度下隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，PC12細(xì)胞活力逐漸下降，比較有顯著性差異(P＜0.05)(圖二A，B)。 與MPP~+200μmol·L-1孵育24h組相比，聯(lián)合組(MSCs上清液濃度分別為30μl、60μl、120μ1)，細(xì)胞活力由0.47±0.02上升至0.67±0.03、0.77±0.02、0.85±0.01；與48h組相比，聯(lián)合組細(xì)胞活力由0.30±0.04上升至0.50±0.01、0.65±0.05、0.75±0.05(圖二C)，比較有顯著性差異(P＜0.05)，隨著MSCs上清液劑量的增加，PC12細(xì)胞活力逐漸增加，且相鄰劑量間比較有顯著性差異(P＜0.05)(圖二C)。 4、透射電鏡能觀(guān)察到MPP~+所致PC12細(xì)胞凋亡 觀(guān)察到細(xì)胞體積縮小和染色質(zhì)濃縮、邊集，核周隙增大，核質(zhì)比小，細(xì)胞膜不完整等細(xì)胞凋亡征象(圖三B)。 5、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示MSCs上清液可以降低MPP~+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的凋亡率 空白對(duì)照組PC12細(xì)胞的凋亡率為(1.51±0.11)％，在100μmol·L-1，200μmol·L-1，400μmol·L-1 MPP~+作用PC12細(xì)胞24h后，細(xì)胞的凋亡率分別增加至(27.76±1.45)％、(42.04±3.21)％、(56.63±4.01)％(P＜0.05)(圖四A)。作用48h后，空白對(duì)照組PC12細(xì)胞的凋亡率為(1.54±0.18)％，MPP~+暴露組細(xì)胞的凋亡率分別增加至(43.78±3.29)％、(55.36±3.98)％、(79.35±6.25)％(P＜0.05)(圖四B)。200μmol·L-1MPP~+作用PC12細(xì)胞24h后，細(xì)胞的凋亡率為(42.34±3.21)％，加入30μ1、60μl、120μl MSCs上清液同時(shí)處理24h后，PC12細(xì)胞的凋亡率分別降為(31.96±2.89)％、(17.89±1.78)％、(10.08±0.91)％(P＜0.05)(圖五A)；作用48h后，細(xì)胞的凋亡率為(55.36±3.98)％，加入30μl、60μl、120μl MSCs上清液同時(shí)處理48h后，PC12細(xì)胞的凋亡率分別降為(39.43±3.08)％、(23.13±2.18)％、(14.21±1.41)％(P＜0.05)(圖五B)；隨著MSCs上清液濃度的增加，PC12細(xì)胞的凋亡率依次降低，相鄰濃度之間比較有顯著差異(P＜0.05)。 6、免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示MSCs上清液可以增加bcl-2和TH蛋白的表達(dá)，降低c-Jun和caspase3蛋白的表達(dá) bcl2和TH在200μmol·L-1MPP~+損害后48h，聯(lián)合組bcl2和TH熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與MPP~+損害組相比，明顯增加(圖六和圖七)。 c-Jun和caspase3在200μmol·L-1MPP~+損害后48h，聯(lián)合組c-Jun和caspase3熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與MPP~+組相比，明顯減少(圖八和圖九)。 7、RT-PCR法顯示MSCs上清液可以增加bcl-2和TH mRNA的表達(dá)，減少c-Jun和caspase3mRNA的表達(dá) 聯(lián)合組(MSCs上清液濃度分別為30μ1、60μl和120μl)損害后24和48h，bcl-2和THmRNA表達(dá)量與GADPHmRNA比值分別升至0.63±0.02、0.71±0.02、0.85±0.01(24h)和0.49±0.01、0.57±0.01、0.67±0.01(48h)及0.55±0.02、0.62±0.01、0.69±0.01(24h)和0.43±0.02、0.52±0.01、0.60±0.01(48h)；聯(lián)合組的bcl2和THmRNA含量均高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的MPP~+組(P＜0.05)；隨著MSCs上清液濃度的增加，bcl2和THmRNA表達(dá)量依次增加，相鄰劑量之間bcl2和THmRNA表達(dá)量比較有顯著差異(P＜0.01)(圖十A，B和圖十一A，B)。 聯(lián)合組(MSCs上清液濃度為30μl、60μl和120μl)損害后24和48h，c-Jun和caspase3mRNA表達(dá)量與GADPHmRNA比值分別降至0.59±0.01、0.52±0.02、0.43±0.01(24h)和0.68±0.02、0.60±0.01、0.52±0.01(48h)及0.59±0.01、0.53±0.01、0.44±0.03(24h)和0.63±0.01、0.56±0.01、0.50±0.01(48h)：聯(lián)合組的c-Jun和caspase3mRNA含量與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的MPP~+組比較明顯減低(P＜0.01)；隨著MSCs上清液濃度的增加，c-Jun和caspase3mRNA表達(dá)量依次降低，相鄰劑量之間c-Jun和caspase3mRNA表達(dá)量比較有顯著差異(P＜0.01)(圖十C，D和圖十一C，D)。 結(jié)論 研究發(fā)現(xiàn)MSCs除了分化為間充質(zhì)細(xì)胞譜系外，還具有向非間充質(zhì)細(xì)胞譜系如神經(jīng)細(xì)胞分化的多向分化潛能。MSCs在體外容易分離培養(yǎng)，并且具有很高擴(kuò)增能力，使其成為最吸引人、最理想的治療工具。對(duì)MSCs研究中的一項(xiàng)難題是迄今還未發(fā)現(xiàn)特異性的MSCs細(xì)胞標(biāo)記物。目前比較公認(rèn)的相對(duì)特異性的MSCs細(xì)胞標(biāo)記物是表達(dá)CD90，CD71及CD44抗原，而無(wú)CD34，CD45和CD11b等造血干細(xì)胞的抗原標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD44和CD45，標(biāo)記為CD44陽(yáng)性和CD45陰性的細(xì)胞即為實(shí)驗(yàn)所需的MSCs。MSCs對(duì)DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用考慮與其能分泌的細(xì)胞因子有關(guān)，可能是MSCs減少神經(jīng)元凋亡的機(jī)制之一。在生理狀態(tài)下，MSCs可以分泌NGF、VEGF、GDNF、BDNF、bFGF、HGF、CSF 1等多種生長(zhǎng)因子；分泌IL-6、IL-7、IL-8、IL-11等細(xì)胞因子；這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可能通過(guò)不同的機(jī)制，起著神經(jīng)保護(hù)作用，減少神經(jīng)元凋亡。MSCs治療PD的一個(gè)機(jī)制是MSCs可以刺激產(chǎn)生多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。本實(shí)驗(yàn)用ELISA法檢測(cè)到MSCs培養(yǎng)上清中能分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子GDNF、BDNF及IL-6。MSCs分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子GDNF、BDNF及IL-6對(duì)MPP~+損壞的DA能神經(jīng)元發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。尤其GDNF是公認(rèn)的能促進(jìn)中腦DA細(xì)胞存活的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。GDNF對(duì)發(fā)育及成熟的DA能神經(jīng)元有保護(hù)、修復(fù)作用，可增強(qiáng)體外培養(yǎng)的DA能神經(jīng)元對(duì)DA的攝取，促進(jìn)DA能神經(jīng)元的分化。BDNF對(duì)培養(yǎng)的胚胎基底前腦膽堿能神經(jīng)元、黑質(zhì)DA能神經(jīng)元和氨基丁酸能神經(jīng)元均有營(yíng)養(yǎng)作用。IL-6作用于DA(兒茶酚胺)能神經(jīng)元，酪氨酸羥化酶活性增強(qiáng)，神經(jīng)元生存期延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)DA增多。本研究MTT法揭示了與MPP~+暴露組相比，聯(lián)合組細(xì)胞活力明顯提高。表明MSCs上清液可以有效保護(hù)MPP~+對(duì)PC12細(xì)胞的毒性損傷，并且濃度越高M(jìn)SCs上清液的保護(hù)作用越好。PI染色FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與MPP~+暴露組相比，聯(lián)合組細(xì)胞的凋亡率明顯降低，提示MSCs上清液可明顯減輕MPP~+對(duì)PC12細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用；隨著MSCs上清液濃度的增加，其減輕MPP~+對(duì)PC12細(xì)胞的凋亡作用在增加。帕金森病是一種慢性進(jìn)展性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，帕金森病的發(fā)病機(jī)制一直是人們研究和關(guān)注的熱點(diǎn)，近年來(lái)隨著神經(jīng)生物化學(xué)和組織化學(xué)研究技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡與帕金森病發(fā)生存在重要聯(lián)系。黑質(zhì)DA能神經(jīng)元凋亡的細(xì)胞內(nèi)部調(diào)控是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，ROS、bcl2、bax、caspases3均充當(dāng)了重要的角色，其核心環(huán)節(jié)可能是內(nèi)外環(huán)境的毒素破壞了鈣離子平衡，造成鈣超載，導(dǎo)致呼吸鏈產(chǎn)生自由基增多，降低bcl2，并激活caspases3來(lái)共同參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，最終引起DA能神經(jīng)元的凋亡。本研究免疫細(xì)胞化學(xué)法bcl2蛋白檢測(cè)結(jié)果提示聯(lián)合組bcl2熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與相應(yīng)時(shí)點(diǎn)MPP~+損害組相比，明顯增加，提示MSCs上清液可通過(guò)增加抗凋亡因子bcl2蛋白含量，減輕MPP~+對(duì)PC12細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用；RT-PCR法bcl2mRNA的檢測(cè)結(jié)果提示聯(lián)合組的bcl2mRNA含量均高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的MPP~+組，提示MSCs上清液可明顯增加抗凋亡因子bcl2mRNA含量，從而減輕MPP~+對(duì)PC12細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用；隨著MSCs上清液濃度的增加，bcl2mRNA表達(dá)量依次增加。以上結(jié)果從mRNA水平提示，隨著MSCs上清液濃度的增加，其減輕MPP~+對(duì)PC12細(xì)胞的凋亡作用在增加。bcl2蛋白是一種膜整合蛋白，存在于細(xì)胞的線(xiàn)粒體、核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。研究表明，bcl2蛋白對(duì)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用可以通過(guò)抗氧化作用來(lái)實(shí)現(xiàn)。我們的研究顯示，MSCs可以改善MPP~+損害所致的bcl2mRNA和蛋白水平的下調(diào)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究免疫細(xì)胞化學(xué)法c-Jun和caspase3蛋白檢測(cè)結(jié)果提示相對(duì)于MPP~+組，聯(lián)合組的熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少。提示MSCs上清液可通過(guò)降低促凋亡因子c-Jun和caspase3蛋白含量，減輕MPP~+對(duì)PC12細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用；RT-PCR法c-Jun和caspase3mRNA的檢測(cè)結(jié)果提示聯(lián)合組的c-Jun和caspase3mRNA含量均低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的MPP~+組，提示MSCs上清液可明顯降低促凋亡因子c-Jun和caspase3mRNA含量，從而減輕MPP~+對(duì)PC12細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用；隨著MSCs上清液濃度的增加，C-Jun和caspase3mRNA表達(dá)量依次降低。以上結(jié)果從mRNA水平提示，隨著MSCs上清液濃度的增加，其減輕MPP~+對(duì)PC12細(xì)胞的凋亡作用在增加。caspase是細(xì)胞凋亡的效應(yīng)器，特別是caspase3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的丟失是PD的主要病理特點(diǎn)。用免疫組化方法測(cè)定PD患者死亡后腦組織時(shí)發(fā)現(xiàn)，中腦DA能神經(jīng)元的丟失與caspase3陽(yáng)性神經(jīng)元呈正相關(guān)。我們的研究顯示MSCs通過(guò)阻斷caspases3的活化來(lái)抑制細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。已確定的凋亡前信號(hào)分子JNK(c-JunN末端激酶)與神經(jīng)退變性疾病相關(guān)。JNK信號(hào)級(jí)聯(lián)可能是MPTP誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡的機(jī)制之一。JNK可使與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的谷胱甘肽-c-Jun聚合蛋白氨基末端磷酸化，從而啟動(dòng)c-Jun介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。MSCs對(duì)DA神經(jīng)元的這種保護(hù)作用可能與其抑制JNK活性，減少c-Jun磷酸化作用有關(guān)。 MSCs可在體外迅速擴(kuò)增；其表面抗原CD44陽(yáng)性而CD45陰性；MPP~+能誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡；MSCs能分泌GDNF、BDNF、IL6等多種對(duì)退變DA能神經(jīng)元有保護(hù)作用的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，因此MSCs對(duì)MPP~+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用，這種保護(hù)作用的強(qiáng)弱與其上清液濃度有關(guān)，其作用機(jī)制是通過(guò)增加抗凋亡因子bcl2和抑制促凋亡因子c-Jun和caspase3等多種渠道來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究為MSCs治療帕金森病提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:The protective effect of bone marrow mesenchymal stem cells on the apoptosis of PC12 cells induced by 1- methyl 4 phenyl pyridine ion
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 賈延R

本文編號(hào)：1342049