本文關(guān)鍵詞：JEV-YFV嵌合病毒作為黃熱病毒疫苗的抗原性和免疫原性研究

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【摘要】：以乙腦疫苗株SA14-14-2的DNA-based復(fù)制子質(zhì)粒和YF-17D prME基因為基礎(chǔ),構(gòu)建新型人工JEV-YFV嵌合病毒,評價該嵌合病毒作為黃熱病毒減毒活疫苗的抗原性和免疫原性。利用DNA-based雙質(zhì)粒系統(tǒng),把SA14-14-2的prM-E基因用YF-17D的prM-E基因進行替換,構(gòu)建SA14-14-2和YF-17D疫苗株的嵌合型cDNA克隆,轉(zhuǎn)染細胞獲得JEV-YFV嵌合病毒。采用噬斑法、鑒定實驗、免疫學(xué)實驗、動物實驗等對獲得的拯救病毒進行生物學(xué)特性研究和疫苗有效性評價。JEV-YFV嵌合型cDNA轉(zhuǎn)染Vero細胞后,獲得拯救病毒,病毒滴度達到1.39×107PFU/mL,噬斑呈現(xiàn)“針尖”樣,與YF-17D噬斑大小形態(tài)相近,但略小于SA14-14-2產(chǎn)生的噬斑。血清學(xué)方法鑒定證實為乙腦／黃熱病毒嵌合病毒,命名為rYJ。通過免疫學(xué)實驗、神經(jīng)毒性實驗、攻毒等實驗,發(fā)現(xiàn)rYJ和YF-17D對3-4周齡Balb/c小鼠均無神經(jīng)外毒性,有相似的神經(jīng)內(nèi)毒性。rYJ免疫后小鼠血清抗體陽轉(zhuǎn)率達到100%,中和抗體滴度達到1：40,與YF-17D基本相同,用100000 LD50 YFV進行攻毒,rYJ免疫組和YF-17D免疫組均達到100%的保護效力。rYJ嵌合病毒的成功構(gòu)建進一步支持了SA14-14-2成為新型疫苗載體的可能性,作為YFV減毒疫苗株,其具有良好的的抗原性和免疫原性,但是出于疫苗安全性考慮,我們可以對病毒的包膜E區(qū)進行改造,進一步降低對戒奶小鼠的神經(jīng)內(nèi)毒性,研制比現(xiàn)用疫苗YF-17D毒性更小的新型疫苗。
【關(guān)鍵詞】：黃熱病毒 DNA-based雙質(zhì)粒系統(tǒng) 嵌合病毒
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392-33
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 英文縮略語表10-12
• 1 前言12-19
• 1.1 黃熱病毒及其疫苗12-15
• 1.1.1 黃熱病毒簡介12
• 1.1.2 黃熱病的免疫與治療12-13
• 1.1.3 YF-17D疫苗的不良反應(yīng)13
• 1.1.4 YF DNA疫苗13-14
• 1.1.5 滅活YFV疫苗14-15
• 1.1.6 YFV亞單位疫苗15
• 1.2 日本腦炎疫苗SA14-14-2及以其為骨架構(gòu)建的嵌合疫苗15-16
• 1.2.1 SA14-14-2簡介15
• 1.2.2 JEV-DENV2嵌合病毒疫苗15-16
• 1.2.3 JEV-TBEV嵌合病毒疫苗16
• 1.2.4 JEV-DENV4嵌合病毒疫苗16
• 1.3 病毒疫苗研究概況16-18
• 1.3.1 病毒減毒活疫苗16-17
• 1.3.2 病毒滅活疫苗17
• 1.3.3 病毒基因工程亞單位疫苗17
• 1.3.4 病毒嵌合疫苗17
• 1.3.5 病毒合成肽疫苗17-18
• 1.3.6 病毒核酸疫苗18
• 1.4 本研究的目的與意義18-19
• 2 實驗材料與方法19-31
• 2.1 材料19-20
• 2.1.1 病毒19
• 2.1.2 質(zhì)粒19
• 2.1.3 細胞19
• 2.1.4 實驗動物19
• 2.1.5 培養(yǎng)基19-20
• 2.1.6 試劑20
• 2.2 實驗方法20-31
• 2.2.1 YFV prME基因的釣取20-21
• 2.2.2 融合PCR獲得JEV-YFV嵌合基因片段21
• 2.2.3 雙質(zhì)粒系統(tǒng)構(gòu)建JEV/YFV嵌合型cDNA21
• 2.2.4 轉(zhuǎn)染21-22
• 2.2.5 JEV-YFV嵌合型拯救病毒的鑒定22-27
• 2.2.5.1 噬斑試驗22
• 2.2.5.2 拯救病毒的基因組序列鑒定22-25
• 2.2.5.3 拯救病毒的放大培養(yǎng)和傳代25
• 2.2.5.4 間接免疫熒光25-26
• 2.2.5.5 IHC試驗26
• 2.2.5.6 流式細胞儀檢測拯救病毒26
• 2.2.5.7 Western blot26-27
• 2.2.5.8 拯救病毒生長曲線的繪制27
• 2.2.6 拯救病毒的體內(nèi)活性鑒定27-28
• 2.2.6.1 rYJ在戒奶小鼠體內(nèi)神經(jīng)外毒性檢測27
• 2.2.6.2 rYJ在乳鼠體內(nèi)神經(jīng)內(nèi)毒性檢測27
• 2.2.6.3 rYJ在戒奶小鼠體內(nèi)神經(jīng)內(nèi)毒性檢測27
• 2.2.6.4 拯救病毒戒奶小鼠腦內(nèi)LD_(50)檢測27-28
• 2.2.6.5 拯救病毒小鼠免疫試驗28
• 2.2.7 血清中特異性抗體鑒定28
• 2.2.7.1 間接ELISA試驗28
• 2.2.7.2 50%噬斑減少試驗28
• 2.2.8 病毒血癥檢測28-29
• 2.2.9 小鼠細胞免疫試驗29
• 2.2.9.1 脾細胞懸液的制備29
• 2.2.9.2 細胞因子IFN-γ檢測29
• 2.2.10 小鼠攻毒試驗29-30
• 2.2.11 統(tǒng)計學(xué)分析30-31
• 3 實驗結(jié)果31-46
• 3.1 應(yīng)用DNA-based雙質(zhì)粒系統(tǒng)構(gòu)建JEV和YFV的嵌合cDNA31-34
• 3.1.1 構(gòu)建策略31-33
• 3.1.2 重組嵌合cDNA鑒定33-34
• 3.2 嵌合重組病毒的鑒定34-41
• 3.2.1 獲得嵌合重組病毒34-35
• 3.2.2 重組病毒的序列測定35-36
• 3.2.3 IHC36-37
• 3.2.4 間接免疫熒光試驗37-38
• 3.2.5 Western blot38
• 3.2.6 流式細胞儀檢測拯救病毒38-39
• 3.2.7 生長曲線39-41
• 3.3 重組嵌合病毒神經(jīng)毒性檢測與免疫原性試驗41-46
• 3.3.1 rYJ神經(jīng)外毒性試驗41
• 3.3.2 rYJ神經(jīng)內(nèi)毒性試驗41-42
• 3.3.3 病毒血癥42-43
• 3.3.4 免疫小鼠YFV抗體的檢測43
• 3.3.5 細胞免疫試驗43-44
• 3.3.6 攻毒試驗44-46
• 4 討論與結(jié)論46-50
• 4.1 討論46-49
• 4.2 結(jié)論49-50
• 參考文獻50-53
• 致謝53

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本文編號：1028235